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TENHO A INFORMAR QUE, POR RAZÕES DE FORÇA MAIOR SOBRETUDO A VER COM O MEU TRABALHO DE PESQUISA E DE PROFESSORA, APÓS O MEU REGRESSO A ANGOLA, SOU FORÇADA A PARAR COM AS INSERÇÕES POR UM TEMPO QUE SERÁ, CERTAMENTE, LARGO.
LAMENTO BASTANTE E AGRADEÇO TODO O VOSSO APOIO.
TODAVIA, VOLTAREI.

ESTRUTURA E FUNÇÃO DOS GLÚCIDOS

Fórmula geral. Definição e classificação.

Os carbohidratos são as biomoléculas mais abundantes na face da terra. Cada ano, o processo de fotossíntese, converte mais de 100 bilhões de toneladas de CO₂ em celulose e outros produtos vegetais. Certos carbohidratos (açúcar comum e amido) são a base da dieta da maior parte do mundo e a oxidação dos açúcares é a principal via metabólica fornecedora de energia na maioria das células que não fazem a fotossíntese .

Polímeros insolúveis de carbohidratos funcionam tanto como elementos estruturais, quanto de protecção nas paredes celulares bacterianas e vegetais e nos tecidos conjuntivos dos animais. Outros polímeros de carbohidratos, agem como lubrificantes das articulações esqueléticas e participam do reconhecimento e coesão entre as células. Polímeros mais complexos de carbohidratos, ligados covalentemente a proteínas ou lipídios, agem como sinais que determinam a localização intracelular ou o destino metabólico destas moléculas híbridas, denominadas de glicoconjugados.

Os glúcidos são poliidroxialdeídos ou poliidroxiacetonas (ou seus derivados), ou polímeros capazes de libertar por hidrólise aqueles compostos. Distinguem-se as oses, (glúcidos simples ou monossacáridos) e os ósidos que são aqueles cuja hidrólise origina vária oses (oligo e polissacáridos).

DEFINIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO:

Muitos destes compostos constituem uma fonte de energia para os organismos vivos imediatamente uilizável (glucose), ou como reserva (amido e glicogénio). Outros desempenham uma função estrutural (celulose e quitina).

O termo hidratos de carbono (carbohidratos), deriva do facto de muitos destes compostos (mas não todos) terem a formula geral: (CH₂O)_n. Alguns também contêm nitrogénio, fósforo ou enxofre. O termo açúcar, deriva do grego "sachkaron" que significa açúcar. Este termo deve contudo ser reservado para as oses simples (glicose, fructose etc) e para os di e trissacáridos.

Os carbohidratos estão divididos em três classes fundamentais, de acordo com o seu tamanho, a saber:

-Monossacáridos

-Oligossacáridos
-Polissacáridos

Monossacáridos – ou açúcares simples, são constituídos por uma única unidade de polihidroxialdeído ou cetona. O monossacárido mais abundante na natureza, é a D-Glicose, também chamado de dextrose. Os monossacáridos com mais de quatro átomos de carbono, tendem a ter estrutura cíclica.

Oligossacáridos – são compostos por cadeias curtas de unidades monossacarídicas, ou resíduos unidos entre si por ligações glicosídicas. Dos oligossacáridos, os mais abundantes são os dissacáridos, formados por duas unidades de monossacáridos. A sacarose ou açúcar da cana, é o representante típico desta classe. Ela é composta por dois monossacáridos, cada um deles com 6 áomos de carbono: A D-glucose e a D-fructose. Nas células, a maioria dos oligossacáridos com três ou mais unidades, não ocorrem livres mas, são uidos a moléculas de não-açúcares, tais como lípidos e proteínas, formando glicoconjugados.

Os polissacáridos – São polímeros que contêm mais de 20 unidades de monossacáridos e podem ter até centenas ou milhares de unidades (glicogênio e amido). Alguns, como a celulose têm cadeias lineares, enquanto que outros, como o glicogénio, têm cadeias ramificadas. Glicogénio e celulose consistem em unidades repetitivas de D-glucose, mas eles diferem entre si no tipo de ligação glicosídica e consequentemente têm propriedades e funções biológicas diferentes.

MONOSSACÁRIDOS

As duas famílias de Monossacáridos: Aldoses e Cetoses:

Os monossacáridos são os carbohidratos mais simples e químicamente são aldeídos ou cetonas, contendo um ou mais grupos hidroxila na molécula. Os átomos de carbono nos quais os grupos hidroxila estão unidos, são centros quirais (carbonos assimétricos) e por isso, dão origem a numerosos açúcares estereoisómeros encontrados na natureza. Os açúcares não substituídos (isto é os não derivados), normalmente têm entre 3 a 7 átomos de arbono. São solúveis na água e insolúveis nos solventes polares. A maior parte deles tem sabor doce.

Químicamente eles são:
Aldeídos (polihidroxialdeídos) – Quando possuem vários grupos hidroxila e um grupo carbonilo situado na extremidade da cadeia. Neste caso, formam a família das aldoses.

Cetonas (polihidroxicetonas) - Quando possuem vários grupos hidroxila e um grupo carbonilo situado em outra posição da cadeia. Neste caso formam a família das cetoses.

A aldose mais simples, possuei três átomos de carbono e denomina-se gliceraldeído (aldotriose). A cetose mais simples, também tem 3 átomos de carbono e denomina-se dihidroxiacetona (cetotriose).

Figura: Monossacáridos mais simples. (Lehninger, 4ª edição).

Existem monossacáridos com: 4 átomos de carbono – tetroses (aldotetroses e cetotetroses).

5 átomos de carbono – pentoses (aldopentoses e cetopentoses). A ribose e a dsoxiribose, são componentes dos ácidos nucleicos.

6 átomos de carbono – hexoses (aldohexoses e cetohexoses). A D-glicose e a D-fructose, são os monossacáridos mais comuns na natureza.

7 átomos de carbono – heptoses (aldoheptoses e cetoheptoses). São mais raros ocorrem principalmente como intermediários no metabolismo dos carbohidratos.

ESTEREOISOMERIA

Todos os monossacáridos com três ou mais átomos de carbono, excepto a dihidroxiacetona, contêm um ou mais átomos de carbono assimétrico (quiral), e assim ocorrem em formas isoméricas opticamente activas. O carbono assimétrico, é aquele que possui as suas quatro ligações comprometidas por átomos ou grupos de átomos, todos diferentes.

Figura: Uma das maneiras de repesentar os dois isómeros do gliceraldeído. Os dois estereoisómeros, são imagens especulares um do outro. (Lenhinger, 4ª edição)

A aldose mais simples que tem um carbono assimétrico é o gliceraldeído, ele possui um centro quiral e portanto, tem dois enantiómeros (dois isómeros ópticos diferentes que são a imagem especular um do outro). Por convenção, uma das fórmas é denominada D-isômero e outra L-isômero. Para representar estruturas de açúcares de maneira tridimensional no papel, empregamos correntemente as fórmulas de projecção de Fisher.

Figura: Fórmula de projeção de Fisher. Nesta fórmula, as ligações horizontais, são as que estão projectadas para a frente no modelo bola e bastão e as ligações verticais, são as que estão projectadas para trás. (Lehninger, 4ª edição).

Em geral, uma molécula com n carbonos assimétricos (n centros quirais), pode ter 2ⁿ estereoisómeros. Assim, as aldohexoses com quatro centros quirais têm 2⁴ estereoisómeros = 16 estereoisómeros.

Os estereoisómeros dos monossacáridos podem ser divididos em 2 séries: Série D e série L. Aqueles cujo último carbono de referência se assemelha ao carbono assimétrico do D-gliceraldeído, pertencem á série D. Os que se assemelham ao L-gliceraldeído, pertencem á série L. A maioria dos açúcares encontrados nos organismos, pertence a série D.

Dois açúcares que diferem sómente na configuração ao redor de um único átomo de carbono, são chamados de epímeros (ex: a D-glicose e a D-manose, que diferem apenas no carbono 2, ou a D-glicose e a D-galactose, que diferem no carbono 4).

A maioria dos açúcares, ocorre naturalmente na forma D mas há excepções, como a L-arabinose e os L-isômeros de alguns derivados de açúcares componentes de glicoconjugados.

NOMENCLATURA: Os átomos de carbono de um açúcar são numerados começando-se pela extremidade da cadeia mais próxima ao carbono carbonila. Cada uma das aldoses, tem nome próprio e as cetoses com cinco átomos de carbono, são designadas inserindo o "ul" no nome da aldose correspondente. Por exemplo,: D-ribulose é o nome da cetopentose correspondente à aldopentose ribose. Quanto às cetohexoses, elas fogem a esta regra : Por exemplo a frutose, é a cetose com seis átomos de carbono, não tendo o seu nome derivado de nenhuma aldohexose, mas sim do facto de ser um açúcar muito abundante nas frutas.

ESTRUTURA CÍCLICA DOS MONOSSACÁRIDOS:

Os monossacáridos comuns, possuem estrutura cíclica: Quando em solução aquosa, as aldotetroses e todos os monossacáridos com cinco ou mais átomos de carbono ocorrem predominantemente como estruturas cíclicas (anel) nos quais, o grupo carbonilo forma uma ligação covalente com o oxigênio de um grupo hidroxila ao longo da cadeia. A formação destas estrturas em anel, é o resultado da reacção geral entre aldeídos ou cetonas e alcoois, formando derivados denominados hemiacetais, que apresentam um átomo de carbono assimétrico adicional e assim podem existir mais duas formas estereoisómeras. Por exemplo, quando em solução aquosa a D-glicose existe como um hemiacetal intramolecular. Assim o grupo hidroxila do C-5, reagiu com o grupo aldeído em C-1 e o C-1 passou a ser um novo carbono assimétrico (novo centro quiral), produzindo dois novos estereoisómeros: a e b. É assim formado um anel de 6 átomos, conhecido como piranose, porque se considera semelhante ao anel de seis átomos do pirano. A nomenclatura sitemática para os dois aneis de D-glicose são a-D-glicopiranose e b-D-glicopiranose. Existem aneis de 5 átomos de carbono denominadas de furanoses, pela sua semelhança ao anel de cinco átomos de furano.

Figura: Fórmula de Haworth representando a D-glucopiranose. (Campos;  Entender a Bioquímica; 1ª edição).

Neste tipo de fórmula, para a série D, os isómeros a são aqueles em que o oxidrilo ligado ao carbono 1 (aldoses) ou ao carbono 2 (cetoses) está à direita (isto é, mesmo ao lado da ponte oxídica), enquanto os isómeros b são representados com este oxidrilo á esquerda .

As formas isoméricas dos monossacáridos, que diferem uma da outra apenas na ua configuração ao redor do átomo de carbono hemiacetal, são chamadas de anômeros e o átomo de carbono hemiacetal (antigo carbonila), é chamada de carbono anomêrico.

As cetohexoses também existem nas formas anoméricas a e b. Nestes compostos, o grupo hidroxila em C-5 (ou C-6) reage com o grupo cetônico em C-2, formando um anel furanosídico contendo uma ligação hemiacetal. A D-fructose forma predominantemente uma anel furanosídico, sendo que o anômero mais comum é a b-D-frutofuranose.

As formas cíclicas, são comunmente representadas como fórmulas em perspectiva de Haworth.

DERIVADOS DAS HEXOSES

Existem hexoses simples muito importantes, tais como a glucose, a galactose e a manose, qu além disso possuem derivados, também de grande importância. Neste derivados em geral, um grupo hidroxila no composto original é substituído por um outro grupo, ou um átomo de carbono é oxidado a áxido carboxílico.

   -Desoxirribose

   -Osaminas

   -Ácidos aldónicos

   -Ácidos urónicos

   -Ácidos Aldáricos

   -Ácidos siálicos

   -Viamina C

   -Ésteres fósfóricos das oses

   -Glicósidos

   -Ciclitois

Desoxirribose:-Forma-se quando um grupo hidroxilo de um monossacárido (a ribose) é substituído por um hidrogênio. A 2-desoxirribose é a aldose que intervém na estrutura dos ácidos desoxirribonucleicos (DNA).

 Figura: Desoxirribose, componente do DNA. (Campos, 1ª Edição). 

OSAMINAS – São açúcares (normalmente a glicose, galactose e manose), nos quais o grupo hidroxila em C-2 do açúcar original é substituído por um grupo amino. As osaminas mais comuns, são a glicosamina, galactosamina e a manosamina.

Figura: Osaminas biológicamente mais relevantes. (Campos 1ª edição).

ÁCIDOS ALDÓNICOS- São derivados das aldoses, por oxidação do carbono carbonilo que passa de COH, para COOH. São nomeados substituindo o sufixo "ose" por "ónico".

ÁCIDOS URÓNICOS: -São formados a partir das aldoses, em que o grupo terminal –CH2OH, é oxidado a COOH. O nome é formado pela palavra ácido e a substituição do sufixo "ose" por ácido -urónico.

ÁCIDOS ALDÁRICOS: - São ácidos dicarboxílicos de açúcares, formados por oxidação das aldoses, nos dois átomos de carbono terminais. O nome é formado antepondo a palavra ácido e depois o sufixo –árico.

ÁCIDOS SIÁLICOS: -São constituintes de várias glicoprotteínas e glicolípidos. São derivados do ácido neuramínico. O ácido neuramínico é formado por condensação de uma molécula de ácido pirúvico e uma molécula de D-manosamina.

 Figura: Ácido N-acetilneuramínico. Campos, 1ª edição).

VITAMINA C - O termo vitamina C, é usado para designar compostos que têem a atividade do ácido ascórbico.

Figura: O ácido ascórbico, o representante mais importante do grupo da vitamina C. (Campos, 1ª edição)

ÉSTERES FOSFÓRICOS DAS OSES - Resultam da esterificação da função alcool primária, ou do oxidrilo hemiacetálico ou de ambos.

Figura: Ésteres fosfóricos das oses. (Campos, 1ª edição).

OLIGOSSACÁRIDOS: DISSACÁRIDOS - Os dissacáridos biológicamente mais importantes, são a maltose, a lactose e a sacarose. Eles são constituídos por dois monossacáridos unidos por uma ligação O-glicosídica. A ligação O-glicosídica, é formada entre o grupo hidroxila de um monossacárido e o átomo de carbono anomérico da outra molécula de açúcar.

Maltose: É formada por duas moléculas de glucose. Para a nomenclatura de um oligossacárido. Usam-se as seguintes regras:

• 
  
  Escreve-se a configuração (a ou b) do carbono anomérico do primeiro (o que está á esquerda) monossacarído. O nome desta unidade, tem adicionado o termo piranosil ou furanosil.
  
• Depois escrevem-se o nome do monossacárido a seguir e, se for o último, adicionam-se os termos pirano ou furano, conforme a estrutura dos aneis.
  

Os dois átomos de carbono envolvidos na ligação glicosídica, são representados entre parêntesis, com uma seta ligando os dois números. Por exemplo os símbolos (a-1®4) indicam que a ligação glicosídica é entre o C-1 do primeiro monossacárido (anómero a) e o C-4 do segundo monossacárido.

A sacarose é formada por uma molécula de glucose e outra de frutose (ligação O-glicosídica a-1,2): a-D-glucopiranosil-b-D-frutofuranósido.

A lactose, é formada por uma molécula de glucose e outra de galactose (ligação O-glicosídica b -1,4): b -D-galactopiranosil-D-glicopiranose.

 POLISSSACÁRIDOS
A maioria dos carbohidratos encontrados na natureza, ocorre como polissacáridos, polímeros de média e alta massa molecular. Os polissacáridos, são também chamados de glicanos e diferem entre si em:

 -Unidades monossacarídeas repetitivas.

 -Tipo de ligação que as une.

 -Cumprimento das suas cadeias

 -Grau de ramificação das cadeias.

Quanto aos monossacáridos que os formam, os polissacáridos dividem-se em:

  -Homopolissacáridos

  -Hetreopolissacáridos

 Quanto á sua função nos organismos, os polissacáridos dividem-se em:

  -De reserva combustível (amido e glicogenio)

  -Elementos estruturais (celulose e quitina)

  -Suporte extracelular (peptidioglicanos das paredes celulares)

  -Matriz do tecido conjuntivo

HOMOPOLISSACÁRIDOS DE RESERVA: Amido (células vegetais) e glicogénio (células animais).

Estes dois polissacáridos ocorrem intracelularmente como grandes agregados ou grânulos. A maioria das células vegetais tem a capacidade de sintetizar amido. Porém, ele é particularmente abundante nos tubérculos, como a batata, mandioca, inhame e nas sementes como o milho, trigo, arroz, etc.

O mido composto por dois tipos de polímero da glicose: Amilose e amilopectina. A amilose consiste em unidades de D-glicose, unidas entre si por ligações glicosídicas (a1®4), e as cadeias são longas e não ramificadas. Tais cadeias podem ter massa molecular de uns poucos milhares até um milhão. A amilopectina, ao contrário da milose, é muito ramificada. As ligações glicosídicas encontradas entre as unidades de glicose nas cadeias de amilopectina são (a1®4) mas, nos pontos de ramificação (a cada 20 a 30 unidades), são do tipo (a1®6).

Figura: Cadeias de amilose e de amilopectina. (Campos, 1ª edição)

Glicogénio: É o principal polissacarídeo de reserva nos animais. Também é composto só por unidades de glicose e possui cadeias semelhantes á amilopectina (ligações (a1®4) e ramificações com ligações (a1®6)mas no glicogénio as cadeias são muito mais ramificadas que as da amilopectina (a cada 10 a 12 unidades). O glicogénio é particularmente abundante no fígado e nos músculos.

As moléculas de glicogênio e amido são altamente hidratadas são altamente hidratadas porque elas possuem muitos grupos hidroxila livres, capazes de formar pontes de hidrogênio com a água.

DEXTRANOS: São homopolissacáridos existentes nas bactérias e fungos, constituídos por unidades de glicose unidos por ligações (a1®6)mas, também existem ligações (a1®3); (a1®2) e (a1®4). A placa bacterina, sintetizada por microorganismos que se multiplicam na superfície dos dentes, é rica em dextranos.

Celulose: É um homoplissacárido com funções estruturais. É uma substância fibrosa, resistente e insolúvel na água, que é encontrada na parede celular dos vegetais, particularmente nos troncos, galhos e em todas as partes lenhosas da planta. É composta por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas do tipo (b1®4). Esta diferença confere à celulose estrutura tridimensional muito diferente da do amido. O glicogênio e amido da dieta são hidrolizados por a-amilases (enzimas presentes na saliva e na secreçã pancreática), que rompem as ligações (a1®4). A celulose não pode ser usada pela maioria dos animais como fonte de energia, porque falta-lhes a enzima para hidrolizar as ligações (b1®4).

HETEROPOLISSACÁRIDOS:

Glicosaminoglicanos – O espaço extracelular nos tecidos de animais multicelulares é preenchido com material gelificado (forma de gel), chamado de matrix extracelular, ou substância fundamental, a qual mantém unidas as células de um tecido e fornece uma via porosa para a difusão dos nutrientes e do oxigênio para uma das células. A matrix extracelularé composta por uma rede de heteropolissacáridos chamados de glicosaminoglicanos. Os glicosaminoglicanos, são compostos por unidades repetitivas de dissacáridos, que podem ser compostos por:

• 
  
  N-acetilglicosamina (ou galactosamina), sempre presente.
  
• Ácido glucorônico (ou idurônico) presente na maioria dos casos
  

Alguns hidroxilas destes açúcares, estão estirificados com sulfato, o que dá a estas moléculas uma alta densidade de cargas negativas.

O exemplo clássico de um glicosaminoglucano, é o ácido hialurônico, que contém unidades alternadas de ácido D-glucorônico e N-acetilglucosamina. Para além de outras funções, o ácido hialurônico forma soluções claras altamente viscosas, que serve como lubrificante nos fluídos sinoviais das articulações.

Alguns dos glicosaminoglicanos biológicamente importantes, são:

• Heparina (hepar = fígado em grego), um potente anticoagulante sintetizada nos mastócitos do fígado e é liberado no sangue onde inibe a coagulação, através da sua ligação com a proteína anti-trombina. Essa união, faz com que a trombina se ligue e iniba a trombina que é uma protease essencial para a coagulação.
• Condroitina sulfato (que compõe a matrix das cartilagens, tendões, ligamente e paredes arteriais).
• Dermatana sulfato, que colabora na flexibilidade da pele.
• Queratina sulfato (presente na córnea, cartilagens, ossos, cabelos, unhas, garras)

MÉTODOS DE ESTUDO DOS CARBOHIDRATOS:

O estudo dos carbohidratos, é complexo porque os polissacáridos são muito ramificados e unidos por vários tipos de ligações. Para serem analizados, os oligossacáridos devem ser separados das proteínas, a que estão unidos e depois degradados com detergentes específicos.

Para o estudo dos glúcidos, usam-se os seguintes métodos:

   -Cromatografia de troca iónica

   -Cromatografia de exclusão por tamanho molecular

   -Cromatografia por afinidade

   -Cromatografia líquido-gás

   -Espectrometria de massa

   -Espectroscopia por RNM.

Metabolismo dos aminoácidos (2)

O Glutamato libera o seu grupo amino como amônia no fígado:

Já vimos que os grupos amino são reunidos no fígado na forma do grupo amino de moléculas de glutamato. A seguir, esses grupos amino precisam de ser removidos do glutamato e preparados para a sua excreção. Nos hepatócitos, o glutamato é transportado do citosol para o interior das mitocôndrias onde sofre desaminação oxidativa numa reacção catalizada pela L-glutamato desidrogenase.

A acção combinada de uma aminotransferase e da glutamato desidrogenase é chamada de transdesaminação (figura). Os produtos de uma reacção de transdesaminação, são um a-cetoácido, o a–cetoglutarato e a amónia (NH₄⁺). O a–cetoglutarato é um intermediário do ciclo do ácido cítrico.

A amônia é tóxica para os animais:
A amônia é muito tóxica para os tecidos animais e a sua concentração no sangue é muito bem regulada. Na maior parte dos animais, a mônia livre produzida nos diferentes tecidos por diversas reacções, é convertida em um composto não tóxico antes de ser transportada, através do sangue para o fígado e rins. Nessa função de transporte, o aminoácido fundamental é a glutamina. Esse aminoácido que serve de transportador de grupos amina, é formado durante uma reacção catalizada pela enzima glutamina sintetase. A glutamina é uma forma não tóxica de transporte de amônia e normalmente está presente no sangue humano em concentrações muito maiores do que a de outros aminoácidos. A glutamina serve também de fonte de grupos amino para uma variedade de reacções de biossíntese de diversas moléculas nitrogenadas (nucleótidos, por exemplo).

Ciclo da glicose alanina:
A alanina também desempenha um papel especial no transporte para o fígado dos grupos amino, em forma não tóxica, através do ciclo da glicose alanina (figura).

Nos músculos e em outros tecidos que degradam aminoácidos para empregá-los como combustíveis, os grupos amino são colectados por tansaminação, sob a forma de glutamato. O glutamato, pode então ser convertido em glutamina, para ser transportado até ao fígado, ou então ainda no músculo, pode transferir o seu grupo amina para o piruvato (um produto da glicólise) muscular, e regenerar alanina por acção da alanina aminotransferase. Dessa forma, a alanina passa para o sangue e viaja até ao fígado.

Figura: Transporte da alanina do músculo para o fígado: Esta forma de transporte, permite que a partir de aminoácidos do músculo, o fígado sintetise glicose, no fígado, que através do senague vai novamente para o músculo para a produção de energia.

No citosol das células dos hepatócitos (células do fígado), a alanina aminotransferase transfere o gurpo amina da alanina para o a–cetoglutarato, formando piruvato e glutamato. O piruvato pode ser transformado em glicose, que retorna aos músculos para ser usada como fonte de energia.

Os músculos consomem muita glicose e, principalmente quando em actividade aumentada (corrida rápida), produzem o ácido láctico como produto da glicólise anaeróbia (reacções que ocorrem na ausênciaa de oxigênio). O lactato derivado da glcólise, e o piruvato derivado da transaminação da alanina, sofrem um conjunto de reacçõs no fígado, que os transformam em glicose. Essa glicose é novamente transportada pelo sangue, do fígado até aos músculos, onde é utilizada como fonte de energia. O ciclo de reacções que inclui a transformação da glicose em lactato no músculo e a reconversão do lactato/piruvato em glicose, no músculo é chamado de ciclo de Cori. O nome provém do casal Carl Cori e Gerty Cori que, nas décadas de 1930 e 1940, estudou e esclareceu essa via e o seu papel no metabolismo.

Fontes de Amônia:
Os aminoácidos da dieta, são a maior fonte de da amônia formada em organismos como o nosso. Contudo, ela pode vir de várias outras fontes, a saber:

1. 
   
   Aminoácidos tecidulares – Muitos tecidos, mas principalmente o fígado, formam amónia através das reacções de transaminação seguidas de desaminação (transdesaminação).
   
   
   
   
2. 
   
   Glutamina – Os rins produzem amônia a partir da glutamina, por acção da enzima glutaminase renal. A maior parte dessa amônia é excretada sob a forma de NH₄⁺. Também no intestino existe uma glutaminase intestinal.
   
   
   
   
3. 
   
   Acção bacteriana no intestino – Na luz intestinal, existe a urease bacteriana que produz amônia a partir da ureia. Essa amônia é absorvida pelo organismo, atinge a veia porta e no fígado volta a ser convertida em ureia.
   
   
   
   
4. 
   
   Aminas – Aminas obtidas da dieta e monoamidas utilizada como hormônios, ou neurotransmissores podem produzir amônia pela acção da aminooxidase.
   
   
   
   
5. 
   
   Purinas e pirimidinas – no catabolismo das purinas e das pirimidinas, os grupos amino ligados aos anéis, são liberados como amônia.
   
   
   
   

RESUMO: Destino metabólico dos grupos amino:

1. 
   
   Os seres humanos obtêm do catabolismo oxidativo dos aminoácidos apenas uma pequena fracção da energia total que necessitam. Esses aminoácidos são derivados da quebra normal das proteínas celulares, da degradação das proteínas ingeridas e da quebra das proteínas corporais, quando não existem outras fontes de energia durante o jejum, ou no diabetes mellitus.
   
   
   
   
2. 
   
   As proteínas ingeridas são degradadas por proteases no estômago e no intestino delgado, até a abtenção de aminoácidos que são depois absorvidos pelas células intestinais, passando para a circulação sangínea.
   
   
   
   
3. 
   
   O passo inicial do catabolismo dos aminoácidos consiste na separação do grupo amino, do esqueleto carbonado. Na maioria dos casos, o grupo amino é transferido para o a–cetoglutarato para formar glutamato numa reacção denominada de transaminação. Essa reacção, requer a coenzima piridoxal fosfato.
   
   
   
   
4. 
   
   O glutamato é transportado para a mitocôndria do fígado, onde a enzima glutamato desidrogenase libera o grupo amino sob a forma de amônia (NH₄⁺). A amônia formada em outros tecidos é transportada para o fígado, incorporada na glutamina, ou no caso dos músculos esqueléticos, incorporada na alanina.
   
   
   
   
5. 
   
   O piruvato produzido por desaminação da alanina, é convertido em glicose no fígado, que a seguir é transportada de volta para os músculos esqueléticos, como parte do ciclo glicose-alanina.
   
   
   
   

III- EXCREÇÃO DO NITROGÊNIO E CICLO DA UREIA

As espécies aquáticas, como a dos peixes ósseos, excretam o nitrogênio do grupo amino como amônia, directamente na água. Por isso, esses animais são chaamados de amonotélicos. Os animais terrestres eliminam a amónia ou sob a forma de ácido úrico (os pássaros e répteis) e esses se chamam de uricotélicos ou sob a forma de ureia (homem e outros vertebrados superiores), e por isso se chamam de ureotélicos.

No homem, a ureia é a principal forma de eliminação dos grupos amino oriundos dos aminoácidos e perfaz cerca de 90% dos componentes nitrogenados da urina. A ureia é formada por dois átomos de nitrogênio, proveniete de reacções de transaminação e desaminação e uma molécula de CO₂. Depois de formada no fígado, a ureia é transportada pelo sangue até aos rins, para ser excretada na urina.

Reacções do Ciclo da Ureia: O ciclo da ureia foi descoberto em 1932 por Hans Krebs (que também descreveu o ciclo do ácido cítrico) e um pesquisador associado, Kurt Henseleit. O ciclo da ureia começa no interior da mitocôndria das células do fígado mas, depois continua no citoplasma. O ciclo comporta cinco reacções, a saber:

1. 
   
   Formação do Carbamoil fosfato – A amônia livre presente no interior das mitocôdrias, proveniente maioritáriamente de reacções de desaminação oxidativa, condensa-se com o CO₂, também presente na mitocôndria como produto do processo de respiração celular, para formar o carbamoil fosfato. Essa reação é catalizada pela enzima carbamoil fosfato sintetase I, presente nas mitocôndrias e requer a clivagem de duas moléculas de ATP.
   
   
   
2. 
   
   Formação da Citrulina – A ornitina e citrulina, são aminoácidos básicos que não fazem parte das proteínas celulares, mas participam no ciclo da ureia. Nesta segunda reacção do ciclo da ureia, o carbamoil fosfato se condensa com a ornitina também presente na mitocôndria. Essa reacção é catalizada pela enzima ornitina transcarbamilase e tem como resultado a formação da citrulina, que passa para o citosol.
   
   
   
3. 
   
   Formação do argininossucinato – No citosol a citrulina condensa-se com o aspartato para formar argininossucinato. O grupo a-amino do aspartato fornece o segundo nitrogênio que será no final, incorporado na ureia. A formação do arginossucinato requer a clivagem de uma molécula de ATP em AMP e pirofosfato (PPi), sendo essa a terceira molécula necessária para a síntese da ureia.
   
   
   
4. 
   
   Clivagem do argininossucinato – O argininossucinato é clivado, produzindo arginina e fumarato. A arginina formada nessa reacção serve como precursor imediato da ureia. Essa reacção é catalizada pela enzima arginossucinase, liberando arginina e fumarato (intermediário do ciclo do ácido cítrico).
   
   
   
5. 
   
   Clivagem da arginina, resultando em ornitina e ureia – A enzima arginase, cliva a arginina em ornitina e ureia. Essa enzima se encontra quase exclusivamente no fígado. Dessa forma, enquanto outros tecidos como o rim, podem sintetizar arginina, apenas o fígado pode clivar a arginina e sintetizar ureia.
   
   
   

Figura: Reacções do ciclo da ureia, que ocorrem na mitocôndria e no citoplasma. Também são mostradas as ligações com o ciclo do ácido cítrico.

Destino da uréia: A ureia sai do fígado por difusão e é transportada no sangue, até aos rins, onde é filtrada e excretada na urina.

Parte da ureia difunde no sangue para o intestino onde é clivada pela enzima urease bacteriana, formando CO₂ e NH₃ que em parte é excretado nas fezes e em parte é reabsorvido para o sangue. Em pacientes com insuficiência renal, os níveis de ureia no sangue aumentam, aumentando também o CO₂ e NH₃ formado no intestino que contribui para a hiperamoninemia freaquentemente observada nesses pacientes. A administração oral de neomicina (um antibiótico), reduz o número de bactérias intestinais responsáveis pela produção de NH₃.

Estequiometria geral do ciclo da ureia:

Aspartato + NH₃ + CO₂ + 3ATP Uréia + Fumarato + 2ADP + AMP + 2Pi + Ppi + 3H₂O

Quatro fosfatos de alta energia, são consumidos na síntese de cada molécula de ureia. Assim, a síntese da ureia é irreversível com um ΔG bastante negativo. O glutamato é o precursor imediato de ambos nitrogênios: o da amônia (por desaminação oxidativa catalisada pela glutamato desidrogenase) e do aspartato (por transaminação a partir do oxalacetato, catalisada pela enzima aspartato-aminotransferase). Assim ambos os átomos de nitrogênio da ureia originam-see efetivamente do glutamato, o qual por sua vez recolhe o nitrogênio de outros aminoácidos.

 Regulação do ciclo da ureia:

O N-acetil-glutamato é um activador essencial da carbamoil-fosfato-sintetase I – o passo limitante da velocidade do ciclo da ureia. O N-acetil-glutamato é sintetizado a partir do acetil-CoA e glutamato, em reacção activada pela arginina. Assim sendo, a concentração intra-hepática de N-acetil-glutamato aumentya após a ingestão de uma refeição rica em proteína, que fornece tanto o substrato (glutamato), quanto o regulador da síntese de N-acetil-glutamato. Isso leva a um aumento de velocidade da síntese da ureia.

IV DESTINO DA CADEIA CARBONADA DOS AMINOÁCIDOS

Como já dissemos nas aulas anteriores, o catabolismo dos aminoácidos encontrados nas proteínas envolve a remoção do grupo mino (quer para excreção quer para a síntese de novos compostos aminados), seguindo-se a quebra dos esqueletos carbonados resultantes. As vias de degradação dos esqueletos carbonado de todos os aminoácidos, convergem para formar sete produtos intermediários : 1)- Oxalacetato; 2)- a-cetoglutarato; 3)- Piruvato; 4)-Fumarato; 5)- Acetil-CoA; 6)-Succinil-CoA; 7)- Acetoacetil-CoA. Estes produtos entram diretamente nas vias do metabolismo intermediário, resultando na síntese de glicose ou lipídeos ou na sua oxidação total total, com produção de CO₂ e H₂O.

Aminoácidos Glicogênicos e cetogênicos:
Os aminoácidos podem ser classificados em cetogênicos e glicogênicos, em função do intermediário produzido durante o seu catabolismo (ver figura).

Aminoácidos Glicogênicos:

Os aminoácidos cujo catabolismo produz piruvato ou um dos intermediários do ciclo do ácido cítrico, são denominados de glicogênicos. Esses intermediários são substratos para a gliconeogênese e pode m originar na formação de glicose(fígado) e de glicogênio (fígado e nos músculos).

Aminoácidos cetogênicos:

Os aminoácidos cujo catabolismo produz acetoacetato ou um dos seus percursores (Acetil-CoA ou Aceto-Acetil-CoA, são denominados de cetogênicos.

METABOLISMO GERAL DOS AMINOÁCIDOS (1): DESTINO E TRANSAMINAÇÃO

I – INTRODUÇÃO

Iniciaremos neste capítulo o estudo do catabolismo dos aminoácidos, uma classe de biomoléculas que através da sua degradação oxidativa, dá uma contribuição significativa para a liberação de energia metabólica. O valor da fracção de energia metabólica obtida por oxidação dos aminoácidos, originados quer de proteínas ingeridas, quer de proteínas dos tecidos, varia muito com o tipo de organismo cosiderado e com a situação metabólica em que ele se encontra. Assim, imediatamente após uma refeição, os carnívoros podem obter da oxidação dos aminoácidos até 90% das suas necessidades de energia. Os herbívoros apenas apenas obtêm dessa fonte, uma pequena fracção das suas necessidades energéticas.

Figura: Fontes e destinos dos aminoácidos

A)- Conjunto de aminoácidos:Os aminoácidos liberados pela hidrólise das proteínas da dieta ou das proteínas dos tecidos, misturam-se com outros aminoácidos livres distribuídos pelo organismo. Em conjunto, eles constituem o stock de aminoácidos (figura). Esse stock contém cerca de 100 gramas de aminoácidos e é pequeno em comparação com as proteínas corporais. Os destinos que um aminoácido pode seguir, uma vez dentro do nosso organismo estão representados na figura.

Nos animais, os aminoácidos podem ser degradados para obtenção de energia em três circunstâncias metabólicas diferentes:

1. Durante a síntese e degradação normais das proteínas celulares (renovação ou turnover das proteínas)
2. Quando em uma dieta rica em proteínas, a quantidade de aminoácidos ingeridos, é maior que a quantidade necessária para a síntese de proteínas.
3. Durante o jejum prolongado ou o diabetes melito, quando os carbohidratos estão inacessíveis ou não são utilizados adequadamente, as proteínas corporais são então hidrolizadas e os seus aminoácidos serão empregues como combustível.

COMO SE FAZ A TRANSFORMAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS EM ENERGIA UTILIZÁVEL PELO ORGANISMO?

– Sempre que têm que ser degradados, os aminoácidos perdem os seus grupos amino e os a-cetoácidos assim formados, podem sofre oxidação até CO2 e H2O. Além disso, esses a-cetoácidos também chamados de "esqueletos de carbono dos aminoácidos" podem ser convertidos em glicose.

Todos os aminoácidos contêm um grupo amino. Assim, a via de degradação de cada aminoácido inclui um passo chave no qual o grupo a-amino é separado do esqueleto de carbono e desviado para uma via especializada para o seu metabolismo. Trataremos primeiro do metabolismo do agrupamento amino e da excreção do nitrogénio, depois estudaremos o destino dos esqueletos carbonados derivados dos aminoácidos e, ao longo do caminho, veremos como as vias estão conectadas.

II – DESTINO METABÓLICO DOS GRUPOS AMINO:

A maior parte do nitrogénio da dieta, é consumida na forma de proteínas, perfazendo entre 70-100 gramas de proteínas por dia, na dieta média de um habitante de países desenvolvidos (Estados Unidos por exemplo). As proteínas são em geral grandes demais para serem absorvidas pelo intestino e devem portanto ser hidrolizadas, produzindo aminoácidos que depois podem ser absorvidos. As enzimas proteolíticas responsáveis pela degradação das proteínas, são produzidas por três diferentes órgãos: o estômago, o pâncreas e o intestino delgado (figura).

A digestão das proteínas começa no estômago, que secreta suco gástrico, que é composto por ácido clorídrico e uma pró-enzima, o pepsinogénio. 
 Ácido clorídrico – A sua função consiste essencialmente me desnaturar as proteínas da dieta, para tornar mais fácil a acção das proteases.
Pepsina –É uma endopeptidase, secretada pelas células serosas do estômago, sob a forma de zimogênio inactivo (pró-enzima), o pepsinogênio. O pepsinogênio, pela acção do ácido clorídrico e por auto-catálise da própria molécula de pesina, converte-se na enzima activa a pepsina. A pepsina hidrolisa as proteínas da dieta, convertendo-as em polipeptídeos e alguns aminoácidos livres  Depois do estômago, os polipeptídeos vão para o intestino delgado onde são clivados por um grupo de proteases pancreáticas, resultando em oligopeptídeos e aminoácidos. As principais enzimas proteolíticas do suco pancreático, são: A tripsina e a pepsina.
No intestino delgado existe uma enzima, produzida pelas células luminais do intestino, que é a aminopeptidase que cliva repetidamente o resíduo N-terminal dos oligopeptídeos, produzindo aminoácidos livres e peptídeos menores. Após esta última clivagem os aminoácidos e os dipeptídeos e são absorvidos pelas células intestinais, em cujo citoplasma os dipeptídeos são também hidrolizados, liberando aminoácidos. Os aminoácidos são então liberados para o sistema porta para serem metabolizados pelo fígado ou liberados para a circulação geral. No fígado, os aminoácidos que serão degradados, sofrem antes de mais a remoção do seu grupo a-amino, a que já fizemos referência anteriormente.

 III - REMOÇÃO DOS GRUPOS AMINO

Figura: Reacção de transaminação, catalisada pelas enzimas aminotransferases. O objectivo dessa reacção, é produzir ácido glutâmico e diversos alfa-cetoácidos.


A)- TRANSAMINAÇÃO: Sintese do ácido glutâmico a partir de vários aminoácidos.


 Transaminação, tal como o nome indica, a transaminação é um processo de transferência de um grupo amino de uma maolécula para outra. Esta reacção é catalizada poer enzimas denominadas de aminotransferases.

O primeiro passo no catabolismo dos aminoácidos é a transferência do seu grupo a-amino para o a-cetoglutarato (figura), um intermediário do ciclo de Krebs. Os produtos dessa reacção, são um a-cetoácido resultante do aminoácido anterior, que perde o seu gruo a-amino, e o ácido glutâmico, resultante do a-cetoglutarato após receber o grupo a-amino.

O a-cetoglutarato, desempenha um papel central no metabolismo dos aminoácidos, pois aceita grupos amino de outros aminoácidos e se transforma em glutamato (ou ácido
glutâmico).Essa transferência de grupos amino de um esqueleto carbonado para outro, é catalizada por uma família de enzimas denominada de aminotrasferases (anteriormente denominadas de transaminases) e as reacções catalizadas por essas enzimas são denominadas de reacções de transaminação. Estas enzimas são encontradas no citoplasma de todas as células mas especialmente nas células do fígado, rins e músculo. Todos os aminoácidos, excepto a lisina e da treonina, perdem os seus grupos amina, por tansaminação.

Existem várias aminotransferases, sendo cada uma delas específica para um ou no máximo uns poucos doadores de grupos amino. As aminotransferases são designadas a partir do doador específico do grupo amino, pois o aceitador do mesmo grupo é quase sempre o a-cetoglutarato. As duas mais importantes reacções de transaminação, são catalizadas pelas enzimas alanina-aminotransferase e aspartato-aminatransferase (figura).

1)- Alanina-aminotransferase (ALT)
Também já foi chamada de glutamato:piruvato- transaminase (GPT), está presente em muitos tecidos. A enzima cataliza a transferência do grupo amino da alanina para o a-cetoglutarato, resultando na formação do piruvato (a-cetoácido derivado da alanina) e glutamato (aminoácido derivado do a-cetoglutarato). Durante o catabolismo dos aminoácidos, essa reacção é fácilmente reversível. No entanto, está quase sempre favorecida a formação do glutamato e desse modo o glutamato actua efetivamente como um colector de nitrogênio a partir da alanina.

2)- Aspartato aminotransferase (AST)
Inicialmente denominada de glutamato:oxalacetato-transaminase (GOT), é uma excepção a regra de que as aminotransferases afunilam os grupos amino para formar glutamato. Durante o catabolismo dos aminoácidos, a AST transfere grupos amino do glutamato para o oxalacetato, formando aspartato, o qual é utilizado como fonte de nitrogênio no ciclo da ureia.

Figura: Interconversão cíclica do piridoxal-fosfato e piridoxamina fosfato, durante a reacção da aspartato amino-transferase.

 Mecanismo de acção das aminotransferases
Todas as aminotransferases requerem a coenzima piridoxal-fosfato (um derivado da vitamina B6), a qual está covalentemente ligada ao grupo Ɛ-amino de um resíduo específico de lisina no sítio activo da enzima. As aminotransferases atuam transferindo o grupo amino de um aminoácido para a porção piridoxal da coenzima, gerando piridoxamina-fosfato. A forma piridoxamina da coenzima reage então com o a-cetoácido para formar um aminoácido, ao mesmo tempo regenerando a forma aldeído original da coenzima. A figura  mostra essas duas reacções, componentes da reacção catalizada pela aspartato-aminotransferase.

Equilíbrio das reacções de tansaminação

Para a maiorias das reacções de transaminação, a constante de equilíbrio aproxima-se de 1 (um), permitindo que a reacção funcione em ambos os sentidos, isto é, no sentido da formação  de um alfa-cetoácido por remoçao do grupo a-amino de um determinado aminoácido, e no sentido da biossíntese de um aminoácido por adição do um grupo a-amino a um a-cetoácido (o que acontece por exemplo quando o suprimento de aminoácidos a partir da dieta não for adequado para satisfazer as necessidades de síntese das células). 

Valor diagnóstico das aminotransferases plasmáticas
As aminotransferases, são normalmente enzimas intracelulares, de modo que os baixos níveis observados no plasma, representam a liberação de conteúdos celulares durante a renovação celular normal. A presença de níveis plasmáticos elevados de aminotransferases indica lesão em células, ricas nessas enzimas. Por exemplo o trauma físico ou um processo patológico, podemcausar lise celular, resultando na liberação dessas enzimas para o sangue. Tanto a AST como a ALT, são de valor diagnóstico especial, quando aparecem elevadas no plasma e isso acontece acontece nas seguintes situações: 

1- Doença hepática:
Os níveis de AST e ALT estão elevados em quase todas as doenças hepáticas mas estão especialmente elevadas nas doenças que causam necrose celular, como na hepatite viral, lesão tóxica e colapso circulatório prolongado. A ALT é mais específica do que a AST para as doenças hepáticas mas a AST é mais sensível, pois o fígado contém maior quantidade dessa enzima.

2- Doença não hepática:
As aminotransferases podem estar elevadas em doenças não hepáticas, como no infarto do miocárdio e doenças musculares. Essas doenças, no entanto, são em geral clínicamente distintas das doenças hepáticas.

B)- DESAMINAÇÃO: a glutamato desidrogenase.

A desaminação oxidativa consiste na remoção do grupo amino de um aminoácido, sob a forma de amônia livre. Esta reacção é catalizada pela enzima glutamato desidrogenase e ocorre principalmente no fígado e no rim. As reacções de desaminação fornecem alfa-cetoácidos que podem entrar nas vias centrais do metabolismo energético, e amónia que serve para a sintese da ureia Ver figura). 

Figura: Reacção de desaminação oxidativa:  Formação do alfa-cetoglutarato e amónia livre, a partir do glutamato.

A glutamato desidrogenase: 
Como descrito anteriormente, os grupos amino da maioria dos aminoácidos são no fim transferidos para o alfa–cetoglutarato, para a sínstese do glutamato, por meio da transaminação. O glutamato é especial porque é o único aminoácido que sofre rápida desaminação oxidativa – uma reacção catalisada pela enzima glutamato desidrogenase (ver figura).

Portanto, a acção da transaminação, resulta na coleta de grupos amino de outros aminoácidos que são inseridos no a-cetoglutarato, produzindo glutamato). A reacção de desaminação oxidativa subsequente desse glutamato, regenera o a-cetoglutarato e fornece uma via pela qual os grupos amino da maioria dos aminoácidos podem ser liberados como amónia (figura).

A glutamato desidrogenase, tem as seguintes características: 

1- Coenzimas:
A glutamato desidrogenase pode utilizar tanto o NAD+ como o NADP+ como coenzima. O NAD+ é utilizado na reacção de desaminação oxidativa, enquanto que o NDP+ é utilizado na aminação redutora, isto é, no ganho de amónia com redução do esqueleto carbonado, para formar glutamato.  

2- Sentido da reacção:
O sentido da reacção depende das concentrações relativas do glutamato, a-cetoglutarato e amónia e da razão das coenzimas oxidadas e reduzidas. Por exemplo, após a ingestão de uma refeição contendo proteínas os níveis de glutamato no fígado são elevados e a reacção ocorre no sentido de degradação de aminoácidos e da formação de amónia. Esta reacção também pode ser utilizada para sintetizar aminoácidos a partir de a-cetoácidos correspondentes.

 

PROTEÍNAS: ESTRUTURA E FUNÇÃO.

Introdução

Os 20 aminoácidos comummente encontrados em proteínas, estão unidos entre si por ligações peptídicas. A sequência linear dos aminoácidos ligados, contém a informação necessária para formar uma molécula proteica com uma estrutura tridimensional única. A estrutura final de uma proteína, é uma organização complexa, que só pode ser compreendida se considerarmos a molécula em termos de quatro níveis de organização, denominados primário, secundário, terceário e quaternário.

II)- Estrutura das proteínas

1)-Estrutura primária das proteínas: A estrutura primária de uma proteína, é a sequência de aminoácidos, unidos por ligação peptídica. Esta estrutura é muito importante, pois muitas doenças genéticas resultam em proteínas com sequências anormais de aminoácidos, ocasionando uma organização irregular, com perda e prejuízo da função normal. Entre nós, o exemplo mais ilustrativo, é a anemia falciforme, uma doença genética, que resulta na produção pelo eritrócito de uma hemoglobina anormal, chamada hemoglobina S. Essa hemoglobina tem as cadeias a normais mas, nas cadeias b, o ácido glutâmico(-) da posição 6, está substituído pela valina (+). Se a estrutura primária das proteínas normais for conhecida, essa informação pode ser usada para diagnosticar ou estudar a doença.

Ligação peptídica:

Nas proteínas, os aminoácidos estão unidos covalentemente por ligações peptídicas, as quais são ligações amida entre o grupo a- carboxila de um aminoácido e o grupo a-amino de outro aminoácido:

A figura representa, a formação da ligação peptídica entre o aminoácido valina e o aminoácido alanina. Como se pode ver, a formação desta ligação covalente, implica a perda de uma molécula de H₂O.

Características da ligação peptídica: A ligação peptídia tem um carácter de dupla ligação parcial, isto é mais curta do que uma lig ação simples e é rígida e planar.

Essa configuração rígida planar, impede a rotação livre da ligação entre o carbono carbonila e o nitrogénio da ligação peptídica.

Entretanto, a ligações entre os carbonos a e os grupos a-amino ou a-carboxila podem rodar livremente (embora com certas limitações, provocadas pelo grupo R). Isso permite com a cadeia polipetídica assuma uma variedade de configurações possíveis. A ligação peptídica, é geralmente uma ligação trans, ao invés de cis, em grande parte devido á interferência dos grupos R, uns com os outros, quando em configuração cis.

Polaridade da ligação peptídica: Como todas as ligações amida, os grupos C=O e –NH da ligação peptídica, não possuem carga, nem aceitam ou fornecem prótons na faixa de pH entre 2-12. Assim, os grupos carregados presentes nas proteínas, são simplesmente os seus grupos R e os grupos a-amino terminal e a-carboxilo terminal. Contudo, os grupos C=O e –NH da ligação peptídica, são polares e estão envolvidos em pontes de hidrogénio que estabilizam a estrutura secundária das proteínas.

Nomeando um peptídeo: Por convenção, a extremidade amino livre da cadeia polipeptídica (N-terminal) é escrita á esquerda, e a extremidade carboxila livre (C-terminal), á direita.

Dessa forma, todas as sequências de aminoácidos são lidas da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminal. Assim, a direcçaõ de leitura do peptídeo representado abaixo será alanina®arginina e nunca arginina®alanina.

A ligação de vários aminoácidos resulta em uma cadeia denominada polipeptídeo. Cada aminoácido é denomina de resíduo. Quando o polipeptídeo é nomeado, os sufixos dos aminoácidos são alterados para –il, com excepção do aminoácido C-terminal. Assim, o dipeptídeo representado acima, será alanil-lisil-histidil-leucil-arginina.

2)-Estrutura Secundária: É a estrutura tridimensional (isso é a configuração espacial), que a proteína assume, devido a sua estrutura primária, que possibilita arranjos regulares de aminoácidos situados próximos uns dos outros. Há vários tipos de estrutura secundária:
a)-a-Hélice
b)-Folha b
c)-Curvaturasb
d)- Estrutura Secundária não repetitiva
e)- Estruturas supersecundárias.

a)-a-Hélice

Existem várias hélice peptídicas encontradas na natureza, mas a a-hélice é a mais comum. É uma estrutura helicoidal, que consiste em um esqueleto polipeptídico central, em espiral e bem compacto, com as cadeias laterais dos aminoácidos que a compõem, estendendo-se para fora da hélice, de modo a impedir a interferência entre si.

Existem várias proteínas biológicamente importantes que possuem este tipo de estrutura secundária. Como exemplo podemos citar a hemoglobina, a mioglobina, as queratinas.
Uma hélice a é estabilizadapor pontes de hidrogénio, entre os átomos de oxigénio dos carbonilas e os átomos de hidrogénio das amidas envolvidas na ligação peptídica, que compõem o esqueleto peptídico, de quatro em quatro resíduos de aminoácidos. Assim cada volta completa (passo) de uma hélice a, contém 3,6 aminoácidos. Existem aminoácidos que quebram a hélice a, como a prolina porque o seu grupo imino não é compatível geométricamente com a espiral. Um grupo de aminoácidos carregados, como o glutamato, aspartato, histidina lisina ou arginina, também quebram a hélice a.

b)- Folha b .

A folha b, é outro tipo de estrutura secundária, na qual todos os componentes da ligação peptídica estão encolvidos com pontes de hidrogénio. As superfícies das folhas b apresentam um aspecto pregueado, motivo pelo qual também são chamadas de folhas b pregueadas.

Comparação entre folha b e a-hélice: Ao contrário da hélice a, as folhas b são compostas de duas ou mais cadeias polipeptídicas (fitas b), ou segmentos da cadeia peptídica, as quais se apresentam totalmente estendidas. Também nas folhas b, as pontes de hidrogénio, são perpendiculares ao esqueleto peptídico.

As folhas b podem ser paralelas (se tiverem o mesmo sentido) ou antiparalelas (de sentido contrário. Quando as pontes de hidrogénio se estabelecem entre duas cadeias polipeptídicas diferentes, elas são chamadas de intercadeias. Quando estas ligações se estabelecem entre aminoácidos da mesma cadeia polipeptídica, são ligações intracadeia.

c)- Curvaturas b (voltas reversas).
As curvaturas b revertem a direcção de uma cadeia polipeptídica, auxiliando a formação de uma estrutura compacta e globular. Elas normalmente são encontradas na superfície das moléculas proteicas e frequentemente contêm resíduos carregados. As curvaturas b geralmente são compostas por quatro aminoácidos, um dos quais pode ser a prolina ou a glicina.

d)- Estrutura secundária não repetitiva
Aproximadamente metade de uma proteína globular média está organizada em estruturas repetitivas como a hélice a ou folhas b. O restante de uma cadeia polipeptídica é decrito como tendo uma conformação em alça ou em espiral.

e)- Estruturas supersecundárias (motivos)
As proteínas globulares são construídas pela combinação de elementos estruturais secundários (hélice a , as folhas b e sequencias não repetitivas). Esses formam principalmente a região central (isso é do interior da molécula). Eles são conectados por regiões em alça (por exemplo curvatura b), na superfície da proteína. As estruturas supersecundárias são normalmente produzidas pelo agrupamento das cadeias laterais estruturais secundários, colocados proximos uns dos outros.
Numa mesma proteína, as as hélice a e as folhas b que estão próximas (adjacentes) uma da outra, devido a sequencia de aminoácidos, também ficarão proximos na proteína após o seu enrolamento final.

3)-Estrutura Terceária da Proteínas
A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica, determina a sua estrutura terceária. A estrutura terceária é dada pelo dobramento dos domínios (que são as unidades básicas da estrutura e função das proteínas) e pelo arranjo final dos domínos da cadeia polipeptídica.
As proteínas globulares (cuja estrutura terceária faz lembrar pequenas esferas) quando em solução aquosa, têm um arranjo compacto, com as cadeias laterais hidrofóbicas colocadas no interior do glóbulo, enquanto que os grupos hidrofílicos ficam colocados na superfície. Todos os grupos hidrofílicos (incluindo a ligação peptídica) que ficarem no interior, estarão envolvidos em ligações pontes de hidrogénio ou interações electrostáticas.

a)- Domínios: São as unidades funcionais fundamentais, com estrutura tridimensional em um polipeptídeo. As cadeias polipeptídicas com mais de 200 aminoácidos, têm dois ou mais domínios. O centro do domínio é formado a partir de combinações de elementos estruturais supersecundários (motivos). O dobramento da cadeia peptídica dentro de um domínio, normalmente ocorre independentemente do dobramento de outro domínio.

Interacções que estabilizam a estrutura terceária
A estrutura tridimensional única de cada polipeptídeo é determinada por sua sequência de aminoácidos. As interacções entre as cadeias laterais do aminoácidos direccionam o dobramento do polipeptídeo para formar uma estrutura compacta. Existem quatro tipos de interacções que cooperam para estabilizar as estruturas terceárias das proteínas globulares:

1. Pontes dissulfeto. Uma ponte dissulfeto, é uma ligação covalente formada por grupos sulfidrila (-SH) de dois resíduos de cisteína, para formar um resíduo de cistina. As duas cisteínas podem estar separadas uma da outra por vários aminoácidos da mesma cadeia polipeptídica, ou podem mesmo estar situados em cadeias diferentes.
   
2. Interacções hidrofóbicas. Os aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas, tendem a estar situados no interior da molécula polipeptídica, onde eles se associam com outros aminoácidos hidrofóbicos. Em contraste os aminoácidos com cadeias laterais polares ou com carga, tendem a ficar na superfície da molécula, em contacto com o solvente. Se a proteína estiver localizada num solvente apolar lipídico, o arranjo tende a ser diferente, isto é, os aminoácidos apolares estarão situados no exterior enquanto que os polares estrão situados no interior da molécula. .
   
   
3. Pontes de hidrogénio. Cadeias laterais de aminoácidos contendo hidrogénio formam pontes de hidrogenio com outras cadeia laterais contendo oxigênio. A formação de pontes de hidrogénio entre grupos polares na superfície de uma proteína e o solvente aquoso aumentam a solubilidade da proteína.
   
4. Interações iónicas. Grupos carregados negativamente como o grupo carboxila (-COO^-) na cadeia lateral do aspartato ou do glutamato, podem interagir com grupos carregados positivamente, como grupo amino (-NH3⁺), na cadeia lateral da lisina.
5. Papel das "Chaperoninas" no dobramento proteico
   O dobramento final de uma proteína, constituindo a sua estrutura terceária, não depende apenas da sua estrutura primária e das interações que se estabelecem entre os aminoácidos. A prova disso, é que a maior parte das proteínas, depois de desnaturadas, não readquire a sua estrutura terceária original. Isso é devido ao facto de que o dobramento particular de várias proteínas é feito com auxílio de um grupo de proteínas chamadas de chaperoninas. As chaperoninas, são também chamadas de "Heat Shock Proteins" ou proteínas de choque térmico.
6. 
   Estrutura Quaternária da Proteínas
   Muitas proteínas consistem em uma única cadeia polipeptídica, sendo definidas como proteínas monoméricas. Outras, entretanto consistem em duas ou mais cadeias polipeptídicas que podem ser estruturalmente idênticas ou totalmente diferentes. Aassociação dessas unidades polipeptídicas é chamado de estrutura quaternária da proteína. Se existem duas subunidades, a proteína é dimérica, se existem três, é trimérica. Mais do que três é polimérica ou multimérica. As subunidades são mantidas unidas por ligações não covalentes como as pontes de hidrogénio, interações hidrofóbicas, ligações iónicas. As subunidades podem funcionar independentemente umas das outras ou cooperarem umas com as outras, como na hemoglonina. Desnaturação das Proteínas
   A desnaturação proteica é o desdobramento e desorganização das estruturas secundária e terceária de uma proteína, mantendo-se intacta a estrutura primária (as ligações peptídicas não se rompem). Os agentes desnaturantes são:
   

1. Calor
   
2. Solventes orgânicos
   
3. Agitação mecânica
   
4. Ácidos ou bases fortes
   
5. Detergentes


6. Íons ou metais pesados como o chumbo ou mercúrio.
   

A desnaturação pode ou não ser reversível. Quando é reversível, a proteína quando colocada novamente em condições ideais, dobra-se novamente em sua estrutura original, assim que agente desnaturante for removido. Entretanto, a maioria das proteínas após a desnaturação não se renatura . As proteínas desnaturadas são insolúveis na água e protanto precipitam em solução.

MÉTODOS DE ESTUDO DAS PROTEÍNAS:

1)-Cromatografia
Método utilizado para separar certas classes de misturas complexas - de compostos orgânicos e inorgânicos – entre uma fase que se move e uma fase estacionária.

a)-Cromatografia de troca iônica
É a técnica mais utilizada para separar, identificar e quantificar os aminoácidos presentes em uma mistura, porém pode também ser usada em outros casos, como para separar proteínas com cargas elétricas diferentes, e misturas de carboidratos. Este método leva em consideração as diferenças no sinal e na magnitude das cargas eléctricas líquidas dos aminoácidos em um dado pH, as quais são previsíveis a partir de seus valores de pKa e de suas curvas de titulação.
O método consiste em tomar um longo tubo com partículas de resina sintética insolúvel em água e contendo grupos fixos carregados electricamente – podem ser resinas trocadoras de cátions ou resinas trocadoras de ânions – e colocar por cima desta coluna de resina a solução de aminoácidos em um pH escolhido. O pH influi na afinidade de cada aminoácido pela resina, pois este determina os estado de ionização da molécula. Os aminoácidos num mesmo pH diferem mesmo assim nos valores de pKa dos seus grupos R, o que explica a tendência diferente de cada um para se ligar à resina. Assim, eles se moverão através da coluna em velocidades diferentes. Os aminoácidos que se movem mais rápido – ou seja, ligam-se à coluna com menos força – são eluídos primeiro, e posteriormente os outros, então, uma a uma as frações são coletadas e seus solutos analisados quantitativamente.
Há também a Cromatografia líquida de alto desempenho, que é uma melhoria moderna, com resinas mais fortes e aparelhamento aperfeiçoado que obtém melhores e mais rápidas separações. O processo se dá automaticamente em um aparelho chamado analisador de aminoácidos.

b)-Cromatografia de exclusão por tamanho
Este método - também conhecido como filtração em gel – separa proteínas (ou outras substâncias, como carboidratos) conforme o tamanho das moléculas. A coluna contém esferas de um polímero poroso, sendo assim, quando a mistura proteica é adicionada as moléculas maiores passam mais rapidamente e aparecem nas primeiras frações pois não penetram nos poros das esferas devido ao tamanho; já as menores, penetram pelos poros e demoram mais a migrar.

c)-Cromatografia de afinidade
Esta técnica separa as proteínas por sua especificidades de ligação. A coluna contém um polímero ao qual está unido um ligante específico para a proteína que interessa. Assim, quando se adiciona a mistura de proteínas à coluna as proteínas indesejadas são transportadas pelo líquido eluente, e ficam retidas somente as proteínas que interessam unidas aos ligantes das esferas de polímero. Então esta proteína de interesse é eluída por uma solução contendo o ligante livre.

d)-Cromatografia em Papel
A cromatografia em papel, apesar de haver técnicas mais modernas, é ainda usada na separação de aminoácidos.
Aplica-se a amostra a 5 cm da extremidade da tira de papel de filtro. Essa tira é suspensa em um recipiente hermeticamente fechado, que contém o solvente cromatográfico.
Os solventes para separação de misturas de aminoácidos são misturas de água, álcoois, ácidos ou bases. Quando a migração do solvente chegar até quase ao fim da fita, esta é seca e tratada para permitir a visualização das moléculas de interesse. Há também a cromatografia em papel bidimensional, em que utiliza-se uma folha de papel quadrado ao invés da tira. E o papel é cromatografado em duas misturas de solventes.

2)-Electroforese
Eletroforese é o movimento de solutos carregados eletricamente em resposta à aplicação de um campo elétrico; freqüentemente é usada para separar misturas de íons, proteínas e ácidos nucleicos.

A eletroforese na separação de proteínas
A eletroforese, em adição à cromatografia, é um processo importante para separar proteínas. Neste caso a separação se dá por migração de moléculas em um campo elétrico. Porém, há o incoveniente de geralmente este método inativar as proteínas. As vantagens são que as proteínas são separadas e visualizadas, e permitir a determinação de propriedades cruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e seu peso molecular aproximado.

A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida, que funciona como uma peneira molecular reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporção aproximada à massa, ou peso molecular, de cada uma delas.

Para determinar-se a pureza e o peso molecular de proteínas um método utilizado faz uso do detergente dodecilsulfato (SDS); este liga-se a maioria das proteínas em quantidades proporcionais ao peso molecular de cada proteína, geralmente uma molécula de SDS para dois resíduos de aminoácidos. Quando o SDS se liga as proteínas a conformação destas é alterada e a maioria adquire a mesma forma, por isso passam a ter a mesma relação entre carga elétrica e massa. Então a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase que exclusivamente por seu peso molecular, sendo que os polipeptídeos menores migram mais rápido. Após a eletroforese as proteínas podem ser visualisadas com um corante como o Azul de Coomassie que se une a elas mas não ao gel.

Eletroforese Bidimensional
É a combinação de dois métodos – a eletroforese em SDS (Sódio Dodecil Sulfato) e a focalização isoelétrica – em géis bidimensionais; conseguindo-se assim a resolução de misturas complexas de proteínas.

A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o ponto isoelétrico (pI) de uma proteína, estabelece-se um gradiente estável do pH no gel através da aplicação de um campo elétrico, então adiciona-se a solução proteica e o campo elétrico é reaplicado, e assim cada proteína migra até atingir o pH que é igual ao seu pI.

A eletroforese bidimensional separa as proteínas de peso molecular idêntico, que diferem em seu pI, ou proteínas com pI similar, porém com peso molecular diferentes. Usa-se primeiramente a focalização isoelétrica, no sentido vertical (coluna) e depois a eletroforese com SDS no sentido horizontal (placa de gel); assim cada sentido indica uma diferença o pI ou o peso molecular.

Espectrometria de massa
É um método para identificar os diferentes átomos que compõe uma substância. Um espectrômetro de massa bombardeia uma substância com elétrons para produzir íons, ou átomos eletricamente carregados. Os íons atravessam um campo magnético que curva suas trajetórias de modos diferentes, dependendo de suas massas. O campo separa os íons em um padrão chamado espectro de massa. A massa e a carga dos íons podem ser medidas por sua posição no espectro. Os cientistas identificam assim os elementos e isótopos presentes na amostra. Para as proteínas, esse método serve principalmente para determinar o peso molecularda proteína e assim contribuir para a sua identificação e caracterização.

PCR (Reação em cadeia da polimerase)

Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.

Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de dianóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para detecção de agentes patogênicos e etc.

Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR

Aplicações
O PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. etc O PCR também é utilizado na paleontologia para o sequenciamento genico de animais pré-históricos.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três grupos fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2^ciclos

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.

Nested PCR
Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externamente para a 1 reação(round) e outro interno ao produto do 1 round. A reacção de 1 round necessita de um maior tempo de extensao devido ao maior produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota do 1 round,que servira de alvo, ao mix de 2 round O produto de 1 round normalmente não é evidenciado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto de 2 round gera grande quantidade de produto e por isso pode ser utilizado na corrida ou para o sequenciamento

A placa contendo o mix e o DNA alvo é "ativado" quando a temperatura atingir 94 graus. Esse procedimento aumenta a especificidade pois a polimerase contem um anticorpo, este anticorpo denatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94. Polimerases que nao possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejado(inespecificos)em temperatura ambiente