METABOLISMO GERAL DOS AMINOÁCIDOS (1): DESTINO E TRANSAMINAÇÃO

I – INTRODUÇÃO

Iniciaremos neste capítulo o estudo do catabolismo dos aminoácidos, uma classe de biomoléculas que através da sua degradação oxidativa, dá uma contribuição significativa para a liberação de energia metabólica. O valor da fracção de energia metabólica obtida por oxidação dos aminoácidos, originados quer de proteínas ingeridas, quer de proteínas dos tecidos, varia muito com o tipo de organismo cosiderado e com a situação metabólica em que ele se encontra. Assim, imediatamente após uma refeição, os carnívoros podem obter da oxidação dos aminoácidos até 90% das suas necessidades de energia. Os herbívoros apenas apenas obtêm dessa fonte, uma pequena fracção das suas necessidades energéticas.

Figura: Fontes e destinos dos aminoácidos

A)- Conjunto de aminoácidos:Os aminoácidos liberados pela hidrólise das proteínas da dieta ou das proteínas dos tecidos, misturam-se com outros aminoácidos livres distribuídos pelo organismo. Em conjunto, eles constituem o stock de aminoácidos (figura). Esse stock contém cerca de 100 gramas de aminoácidos e é pequeno em comparação com as proteínas corporais. Os destinos que um aminoácido pode seguir, uma vez dentro do nosso organismo estão representados na figura.

Nos animais, os aminoácidos podem ser degradados para obtenção de energia em três circunstâncias metabólicas diferentes:

1. Durante a síntese e degradação normais das proteínas celulares (renovação ou turnover das proteínas)
2. Quando em uma dieta rica em proteínas, a quantidade de aminoácidos ingeridos, é maior que a quantidade necessária para a síntese de proteínas.
3. Durante o jejum prolongado ou o diabetes melito, quando os carbohidratos estão inacessíveis ou não são utilizados adequadamente, as proteínas corporais são então hidrolizadas e os seus aminoácidos serão empregues como combustível.

COMO SE FAZ A TRANSFORMAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS EM ENERGIA UTILIZÁVEL PELO ORGANISMO?

– Sempre que têm que ser degradados, os aminoácidos perdem os seus grupos amino e os a-cetoácidos assim formados, podem sofre oxidação até CO2 e H2O. Além disso, esses a-cetoácidos também chamados de "esqueletos de carbono dos aminoácidos" podem ser convertidos em glicose.

Todos os aminoácidos contêm um grupo amino. Assim, a via de degradação de cada aminoácido inclui um passo chave no qual o grupo a-amino é separado do esqueleto de carbono e desviado para uma via especializada para o seu metabolismo. Trataremos primeiro do metabolismo do agrupamento amino e da excreção do nitrogénio, depois estudaremos o destino dos esqueletos carbonados derivados dos aminoácidos e, ao longo do caminho, veremos como as vias estão conectadas.

II – DESTINO METABÓLICO DOS GRUPOS AMINO:

A maior parte do nitrogénio da dieta, é consumida na forma de proteínas, perfazendo entre 70-100 gramas de proteínas por dia, na dieta média de um habitante de países desenvolvidos (Estados Unidos por exemplo). As proteínas são em geral grandes demais para serem absorvidas pelo intestino e devem portanto ser hidrolizadas, produzindo aminoácidos que depois podem ser absorvidos. As enzimas proteolíticas responsáveis pela degradação das proteínas, são produzidas por três diferentes órgãos: o estômago, o pâncreas e o intestino delgado (figura).

A digestão das proteínas começa no estômago, que secreta suco gástrico, que é composto por ácido clorídrico e uma pró-enzima, o pepsinogénio. 
 Ácido clorídrico – A sua função consiste essencialmente me desnaturar as proteínas da dieta, para tornar mais fácil a acção das proteases.
Pepsina –É uma endopeptidase, secretada pelas células serosas do estômago, sob a forma de zimogênio inactivo (pró-enzima), o pepsinogênio. O pepsinogênio, pela acção do ácido clorídrico e por auto-catálise da própria molécula de pesina, converte-se na enzima activa a pepsina. A pepsina hidrolisa as proteínas da dieta, convertendo-as em polipeptídeos e alguns aminoácidos livres  Depois do estômago, os polipeptídeos vão para o intestino delgado onde são clivados por um grupo de proteases pancreáticas, resultando em oligopeptídeos e aminoácidos. As principais enzimas proteolíticas do suco pancreático, são: A tripsina e a pepsina.
No intestino delgado existe uma enzima, produzida pelas células luminais do intestino, que é a aminopeptidase que cliva repetidamente o resíduo N-terminal dos oligopeptídeos, produzindo aminoácidos livres e peptídeos menores. Após esta última clivagem os aminoácidos e os dipeptídeos e são absorvidos pelas células intestinais, em cujo citoplasma os dipeptídeos são também hidrolizados, liberando aminoácidos. Os aminoácidos são então liberados para o sistema porta para serem metabolizados pelo fígado ou liberados para a circulação geral. No fígado, os aminoácidos que serão degradados, sofrem antes de mais a remoção do seu grupo a-amino, a que já fizemos referência anteriormente.

 III - REMOÇÃO DOS GRUPOS AMINO

Figura: Reacção de transaminação, catalisada pelas enzimas aminotransferases. O objectivo dessa reacção, é produzir ácido glutâmico e diversos alfa-cetoácidos.


A)- TRANSAMINAÇÃO: Sintese do ácido glutâmico a partir de vários aminoácidos.


 Transaminação, tal como o nome indica, a transaminação é um processo de transferência de um grupo amino de uma maolécula para outra. Esta reacção é catalizada poer enzimas denominadas de aminotransferases.

O primeiro passo no catabolismo dos aminoácidos é a transferência do seu grupo a-amino para o a-cetoglutarato (figura), um intermediário do ciclo de Krebs. Os produtos dessa reacção, são um a-cetoácido resultante do aminoácido anterior, que perde o seu gruo a-amino, e o ácido glutâmico, resultante do a-cetoglutarato após receber o grupo a-amino.

O a-cetoglutarato, desempenha um papel central no metabolismo dos aminoácidos, pois aceita grupos amino de outros aminoácidos e se transforma em glutamato (ou ácido
glutâmico).Essa transferência de grupos amino de um esqueleto carbonado para outro, é catalizada por uma família de enzimas denominada de aminotrasferases (anteriormente denominadas de transaminases) e as reacções catalizadas por essas enzimas são denominadas de reacções de transaminação. Estas enzimas são encontradas no citoplasma de todas as células mas especialmente nas células do fígado, rins e músculo. Todos os aminoácidos, excepto a lisina e da treonina, perdem os seus grupos amina, por tansaminação.

Existem várias aminotransferases, sendo cada uma delas específica para um ou no máximo uns poucos doadores de grupos amino. As aminotransferases são designadas a partir do doador específico do grupo amino, pois o aceitador do mesmo grupo é quase sempre o a-cetoglutarato. As duas mais importantes reacções de transaminação, são catalizadas pelas enzimas alanina-aminotransferase e aspartato-aminatransferase (figura).

1)- Alanina-aminotransferase (ALT)
Também já foi chamada de glutamato:piruvato- transaminase (GPT), está presente em muitos tecidos. A enzima cataliza a transferência do grupo amino da alanina para o a-cetoglutarato, resultando na formação do piruvato (a-cetoácido derivado da alanina) e glutamato (aminoácido derivado do a-cetoglutarato). Durante o catabolismo dos aminoácidos, essa reacção é fácilmente reversível. No entanto, está quase sempre favorecida a formação do glutamato e desse modo o glutamato actua efetivamente como um colector de nitrogênio a partir da alanina.

2)- Aspartato aminotransferase (AST)
Inicialmente denominada de glutamato:oxalacetato-transaminase (GOT), é uma excepção a regra de que as aminotransferases afunilam os grupos amino para formar glutamato. Durante o catabolismo dos aminoácidos, a AST transfere grupos amino do glutamato para o oxalacetato, formando aspartato, o qual é utilizado como fonte de nitrogênio no ciclo da ureia.

Figura: Interconversão cíclica do piridoxal-fosfato e piridoxamina fosfato, durante a reacção da aspartato amino-transferase.

 Mecanismo de acção das aminotransferases
Todas as aminotransferases requerem a coenzima piridoxal-fosfato (um derivado da vitamina B6), a qual está covalentemente ligada ao grupo Ɛ-amino de um resíduo específico de lisina no sítio activo da enzima. As aminotransferases atuam transferindo o grupo amino de um aminoácido para a porção piridoxal da coenzima, gerando piridoxamina-fosfato. A forma piridoxamina da coenzima reage então com o a-cetoácido para formar um aminoácido, ao mesmo tempo regenerando a forma aldeído original da coenzima. A figura  mostra essas duas reacções, componentes da reacção catalizada pela aspartato-aminotransferase.

Equilíbrio das reacções de tansaminação

Para a maiorias das reacções de transaminação, a constante de equilíbrio aproxima-se de 1 (um), permitindo que a reacção funcione em ambos os sentidos, isto é, no sentido da formação  de um alfa-cetoácido por remoçao do grupo a-amino de um determinado aminoácido, e no sentido da biossíntese de um aminoácido por adição do um grupo a-amino a um a-cetoácido (o que acontece por exemplo quando o suprimento de aminoácidos a partir da dieta não for adequado para satisfazer as necessidades de síntese das células). 

Valor diagnóstico das aminotransferases plasmáticas
As aminotransferases, são normalmente enzimas intracelulares, de modo que os baixos níveis observados no plasma, representam a liberação de conteúdos celulares durante a renovação celular normal. A presença de níveis plasmáticos elevados de aminotransferases indica lesão em células, ricas nessas enzimas. Por exemplo o trauma físico ou um processo patológico, podemcausar lise celular, resultando na liberação dessas enzimas para o sangue. Tanto a AST como a ALT, são de valor diagnóstico especial, quando aparecem elevadas no plasma e isso acontece acontece nas seguintes situações: 

1- Doença hepática:
Os níveis de AST e ALT estão elevados em quase todas as doenças hepáticas mas estão especialmente elevadas nas doenças que causam necrose celular, como na hepatite viral, lesão tóxica e colapso circulatório prolongado. A ALT é mais específica do que a AST para as doenças hepáticas mas a AST é mais sensível, pois o fígado contém maior quantidade dessa enzima.

2- Doença não hepática:
As aminotransferases podem estar elevadas em doenças não hepáticas, como no infarto do miocárdio e doenças musculares. Essas doenças, no entanto, são em geral clínicamente distintas das doenças hepáticas.

B)- DESAMINAÇÃO: a glutamato desidrogenase.

A desaminação oxidativa consiste na remoção do grupo amino de um aminoácido, sob a forma de amônia livre. Esta reacção é catalizada pela enzima glutamato desidrogenase e ocorre principalmente no fígado e no rim. As reacções de desaminação fornecem alfa-cetoácidos que podem entrar nas vias centrais do metabolismo energético, e amónia que serve para a sintese da ureia Ver figura). 

Figura: Reacção de desaminação oxidativa:  Formação do alfa-cetoglutarato e amónia livre, a partir do glutamato.

A glutamato desidrogenase: 
Como descrito anteriormente, os grupos amino da maioria dos aminoácidos são no fim transferidos para o alfa–cetoglutarato, para a sínstese do glutamato, por meio da transaminação. O glutamato é especial porque é o único aminoácido que sofre rápida desaminação oxidativa – uma reacção catalisada pela enzima glutamato desidrogenase (ver figura).

Portanto, a acção da transaminação, resulta na coleta de grupos amino de outros aminoácidos que são inseridos no a-cetoglutarato, produzindo glutamato). A reacção de desaminação oxidativa subsequente desse glutamato, regenera o a-cetoglutarato e fornece uma via pela qual os grupos amino da maioria dos aminoácidos podem ser liberados como amónia (figura).

A glutamato desidrogenase, tem as seguintes características: 

1- Coenzimas:
A glutamato desidrogenase pode utilizar tanto o NAD+ como o NADP+ como coenzima. O NAD+ é utilizado na reacção de desaminação oxidativa, enquanto que o NDP+ é utilizado na aminação redutora, isto é, no ganho de amónia com redução do esqueleto carbonado, para formar glutamato.  

2- Sentido da reacção:
O sentido da reacção depende das concentrações relativas do glutamato, a-cetoglutarato e amónia e da razão das coenzimas oxidadas e reduzidas. Por exemplo, após a ingestão de uma refeição contendo proteínas os níveis de glutamato no fígado são elevados e a reacção ocorre no sentido de degradação de aminoácidos e da formação de amónia. Esta reacção também pode ser utilizada para sintetizar aminoácidos a partir de a-cetoácidos correspondentes.

 

PROTEÍNAS: ESTRUTURA E FUNÇÃO.

Introdução

Os 20 aminoácidos comummente encontrados em proteínas, estão unidos entre si por ligações peptídicas. A sequência linear dos aminoácidos ligados, contém a informação necessária para formar uma molécula proteica com uma estrutura tridimensional única. A estrutura final de uma proteína, é uma organização complexa, que só pode ser compreendida se considerarmos a molécula em termos de quatro níveis de organização, denominados primário, secundário, terceário e quaternário.

II)- Estrutura das proteínas

1)-Estrutura primária das proteínas: A estrutura primária de uma proteína, é a sequência de aminoácidos, unidos por ligação peptídica. Esta estrutura é muito importante, pois muitas doenças genéticas resultam em proteínas com sequências anormais de aminoácidos, ocasionando uma organização irregular, com perda e prejuízo da função normal. Entre nós, o exemplo mais ilustrativo, é a anemia falciforme, uma doença genética, que resulta na produção pelo eritrócito de uma hemoglobina anormal, chamada hemoglobina S. Essa hemoglobina tem as cadeias a normais mas, nas cadeias b, o ácido glutâmico(-) da posição 6, está substituído pela valina (+). Se a estrutura primária das proteínas normais for conhecida, essa informação pode ser usada para diagnosticar ou estudar a doença.

Ligação peptídica:

Nas proteínas, os aminoácidos estão unidos covalentemente por ligações peptídicas, as quais são ligações amida entre o grupo a- carboxila de um aminoácido e o grupo a-amino de outro aminoácido:

A figura representa, a formação da ligação peptídica entre o aminoácido valina e o aminoácido alanina. Como se pode ver, a formação desta ligação covalente, implica a perda de uma molécula de H₂O.

Características da ligação peptídica: A ligação peptídia tem um carácter de dupla ligação parcial, isto é mais curta do que uma lig ação simples e é rígida e planar.

Essa configuração rígida planar, impede a rotação livre da ligação entre o carbono carbonila e o nitrogénio da ligação peptídica.

Entretanto, a ligações entre os carbonos a e os grupos a-amino ou a-carboxila podem rodar livremente (embora com certas limitações, provocadas pelo grupo R). Isso permite com a cadeia polipetídica assuma uma variedade de configurações possíveis. A ligação peptídica, é geralmente uma ligação trans, ao invés de cis, em grande parte devido á interferência dos grupos R, uns com os outros, quando em configuração cis.

Polaridade da ligação peptídica: Como todas as ligações amida, os grupos C=O e –NH da ligação peptídica, não possuem carga, nem aceitam ou fornecem prótons na faixa de pH entre 2-12. Assim, os grupos carregados presentes nas proteínas, são simplesmente os seus grupos R e os grupos a-amino terminal e a-carboxilo terminal. Contudo, os grupos C=O e –NH da ligação peptídica, são polares e estão envolvidos em pontes de hidrogénio que estabilizam a estrutura secundária das proteínas.

Nomeando um peptídeo: Por convenção, a extremidade amino livre da cadeia polipeptídica (N-terminal) é escrita á esquerda, e a extremidade carboxila livre (C-terminal), á direita.

Dessa forma, todas as sequências de aminoácidos são lidas da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminal. Assim, a direcçaõ de leitura do peptídeo representado abaixo será alanina®arginina e nunca arginina®alanina.

A ligação de vários aminoácidos resulta em uma cadeia denominada polipeptídeo. Cada aminoácido é denomina de resíduo. Quando o polipeptídeo é nomeado, os sufixos dos aminoácidos são alterados para –il, com excepção do aminoácido C-terminal. Assim, o dipeptídeo representado acima, será alanil-lisil-histidil-leucil-arginina.

2)-Estrutura Secundária: É a estrutura tridimensional (isso é a configuração espacial), que a proteína assume, devido a sua estrutura primária, que possibilita arranjos regulares de aminoácidos situados próximos uns dos outros. Há vários tipos de estrutura secundária:
a)-a-Hélice
b)-Folha b
c)-Curvaturasb
d)- Estrutura Secundária não repetitiva
e)- Estruturas supersecundárias.

a)-a-Hélice

Existem várias hélice peptídicas encontradas na natureza, mas a a-hélice é a mais comum. É uma estrutura helicoidal, que consiste em um esqueleto polipeptídico central, em espiral e bem compacto, com as cadeias laterais dos aminoácidos que a compõem, estendendo-se para fora da hélice, de modo a impedir a interferência entre si.

Existem várias proteínas biológicamente importantes que possuem este tipo de estrutura secundária. Como exemplo podemos citar a hemoglobina, a mioglobina, as queratinas.
Uma hélice a é estabilizadapor pontes de hidrogénio, entre os átomos de oxigénio dos carbonilas e os átomos de hidrogénio das amidas envolvidas na ligação peptídica, que compõem o esqueleto peptídico, de quatro em quatro resíduos de aminoácidos. Assim cada volta completa (passo) de uma hélice a, contém 3,6 aminoácidos. Existem aminoácidos que quebram a hélice a, como a prolina porque o seu grupo imino não é compatível geométricamente com a espiral. Um grupo de aminoácidos carregados, como o glutamato, aspartato, histidina lisina ou arginina, também quebram a hélice a.

b)- Folha b .

A folha b, é outro tipo de estrutura secundária, na qual todos os componentes da ligação peptídica estão encolvidos com pontes de hidrogénio. As superfícies das folhas b apresentam um aspecto pregueado, motivo pelo qual também são chamadas de folhas b pregueadas.

Comparação entre folha b e a-hélice: Ao contrário da hélice a, as folhas b são compostas de duas ou mais cadeias polipeptídicas (fitas b), ou segmentos da cadeia peptídica, as quais se apresentam totalmente estendidas. Também nas folhas b, as pontes de hidrogénio, são perpendiculares ao esqueleto peptídico.

As folhas b podem ser paralelas (se tiverem o mesmo sentido) ou antiparalelas (de sentido contrário. Quando as pontes de hidrogénio se estabelecem entre duas cadeias polipeptídicas diferentes, elas são chamadas de intercadeias. Quando estas ligações se estabelecem entre aminoácidos da mesma cadeia polipeptídica, são ligações intracadeia.

c)- Curvaturas b (voltas reversas).
As curvaturas b revertem a direcção de uma cadeia polipeptídica, auxiliando a formação de uma estrutura compacta e globular. Elas normalmente são encontradas na superfície das moléculas proteicas e frequentemente contêm resíduos carregados. As curvaturas b geralmente são compostas por quatro aminoácidos, um dos quais pode ser a prolina ou a glicina.

d)- Estrutura secundária não repetitiva
Aproximadamente metade de uma proteína globular média está organizada em estruturas repetitivas como a hélice a ou folhas b. O restante de uma cadeia polipeptídica é decrito como tendo uma conformação em alça ou em espiral.

e)- Estruturas supersecundárias (motivos)
As proteínas globulares são construídas pela combinação de elementos estruturais secundários (hélice a , as folhas b e sequencias não repetitivas). Esses formam principalmente a região central (isso é do interior da molécula). Eles são conectados por regiões em alça (por exemplo curvatura b), na superfície da proteína. As estruturas supersecundárias são normalmente produzidas pelo agrupamento das cadeias laterais estruturais secundários, colocados proximos uns dos outros.
Numa mesma proteína, as as hélice a e as folhas b que estão próximas (adjacentes) uma da outra, devido a sequencia de aminoácidos, também ficarão proximos na proteína após o seu enrolamento final.

3)-Estrutura Terceária da Proteínas
A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica, determina a sua estrutura terceária. A estrutura terceária é dada pelo dobramento dos domínios (que são as unidades básicas da estrutura e função das proteínas) e pelo arranjo final dos domínos da cadeia polipeptídica.
As proteínas globulares (cuja estrutura terceária faz lembrar pequenas esferas) quando em solução aquosa, têm um arranjo compacto, com as cadeias laterais hidrofóbicas colocadas no interior do glóbulo, enquanto que os grupos hidrofílicos ficam colocados na superfície. Todos os grupos hidrofílicos (incluindo a ligação peptídica) que ficarem no interior, estarão envolvidos em ligações pontes de hidrogénio ou interações electrostáticas.

a)- Domínios: São as unidades funcionais fundamentais, com estrutura tridimensional em um polipeptídeo. As cadeias polipeptídicas com mais de 200 aminoácidos, têm dois ou mais domínios. O centro do domínio é formado a partir de combinações de elementos estruturais supersecundários (motivos). O dobramento da cadeia peptídica dentro de um domínio, normalmente ocorre independentemente do dobramento de outro domínio.

Interacções que estabilizam a estrutura terceária
A estrutura tridimensional única de cada polipeptídeo é determinada por sua sequência de aminoácidos. As interacções entre as cadeias laterais do aminoácidos direccionam o dobramento do polipeptídeo para formar uma estrutura compacta. Existem quatro tipos de interacções que cooperam para estabilizar as estruturas terceárias das proteínas globulares:

1. Pontes dissulfeto. Uma ponte dissulfeto, é uma ligação covalente formada por grupos sulfidrila (-SH) de dois resíduos de cisteína, para formar um resíduo de cistina. As duas cisteínas podem estar separadas uma da outra por vários aminoácidos da mesma cadeia polipeptídica, ou podem mesmo estar situados em cadeias diferentes.
   
2. Interacções hidrofóbicas. Os aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas, tendem a estar situados no interior da molécula polipeptídica, onde eles se associam com outros aminoácidos hidrofóbicos. Em contraste os aminoácidos com cadeias laterais polares ou com carga, tendem a ficar na superfície da molécula, em contacto com o solvente. Se a proteína estiver localizada num solvente apolar lipídico, o arranjo tende a ser diferente, isto é, os aminoácidos apolares estarão situados no exterior enquanto que os polares estrão situados no interior da molécula. .
   
   
3. Pontes de hidrogénio. Cadeias laterais de aminoácidos contendo hidrogénio formam pontes de hidrogenio com outras cadeia laterais contendo oxigênio. A formação de pontes de hidrogénio entre grupos polares na superfície de uma proteína e o solvente aquoso aumentam a solubilidade da proteína.
   
4. Interações iónicas. Grupos carregados negativamente como o grupo carboxila (-COO^-) na cadeia lateral do aspartato ou do glutamato, podem interagir com grupos carregados positivamente, como grupo amino (-NH3⁺), na cadeia lateral da lisina.
5. Papel das "Chaperoninas" no dobramento proteico
   O dobramento final de uma proteína, constituindo a sua estrutura terceária, não depende apenas da sua estrutura primária e das interações que se estabelecem entre os aminoácidos. A prova disso, é que a maior parte das proteínas, depois de desnaturadas, não readquire a sua estrutura terceária original. Isso é devido ao facto de que o dobramento particular de várias proteínas é feito com auxílio de um grupo de proteínas chamadas de chaperoninas. As chaperoninas, são também chamadas de "Heat Shock Proteins" ou proteínas de choque térmico.
6. 
   Estrutura Quaternária da Proteínas
   Muitas proteínas consistem em uma única cadeia polipeptídica, sendo definidas como proteínas monoméricas. Outras, entretanto consistem em duas ou mais cadeias polipeptídicas que podem ser estruturalmente idênticas ou totalmente diferentes. Aassociação dessas unidades polipeptídicas é chamado de estrutura quaternária da proteína. Se existem duas subunidades, a proteína é dimérica, se existem três, é trimérica. Mais do que três é polimérica ou multimérica. As subunidades são mantidas unidas por ligações não covalentes como as pontes de hidrogénio, interações hidrofóbicas, ligações iónicas. As subunidades podem funcionar independentemente umas das outras ou cooperarem umas com as outras, como na hemoglonina. Desnaturação das Proteínas
   A desnaturação proteica é o desdobramento e desorganização das estruturas secundária e terceária de uma proteína, mantendo-se intacta a estrutura primária (as ligações peptídicas não se rompem). Os agentes desnaturantes são:
   

1. Calor
   
2. Solventes orgânicos
   
3. Agitação mecânica
   
4. Ácidos ou bases fortes
   
5. Detergentes


6. Íons ou metais pesados como o chumbo ou mercúrio.
   

A desnaturação pode ou não ser reversível. Quando é reversível, a proteína quando colocada novamente em condições ideais, dobra-se novamente em sua estrutura original, assim que agente desnaturante for removido. Entretanto, a maioria das proteínas após a desnaturação não se renatura . As proteínas desnaturadas são insolúveis na água e protanto precipitam em solução.

MÉTODOS DE ESTUDO DAS PROTEÍNAS:

1)-Cromatografia
Método utilizado para separar certas classes de misturas complexas - de compostos orgânicos e inorgânicos – entre uma fase que se move e uma fase estacionária.

a)-Cromatografia de troca iônica
É a técnica mais utilizada para separar, identificar e quantificar os aminoácidos presentes em uma mistura, porém pode também ser usada em outros casos, como para separar proteínas com cargas elétricas diferentes, e misturas de carboidratos. Este método leva em consideração as diferenças no sinal e na magnitude das cargas eléctricas líquidas dos aminoácidos em um dado pH, as quais são previsíveis a partir de seus valores de pKa e de suas curvas de titulação.
O método consiste em tomar um longo tubo com partículas de resina sintética insolúvel em água e contendo grupos fixos carregados electricamente – podem ser resinas trocadoras de cátions ou resinas trocadoras de ânions – e colocar por cima desta coluna de resina a solução de aminoácidos em um pH escolhido. O pH influi na afinidade de cada aminoácido pela resina, pois este determina os estado de ionização da molécula. Os aminoácidos num mesmo pH diferem mesmo assim nos valores de pKa dos seus grupos R, o que explica a tendência diferente de cada um para se ligar à resina. Assim, eles se moverão através da coluna em velocidades diferentes. Os aminoácidos que se movem mais rápido – ou seja, ligam-se à coluna com menos força – são eluídos primeiro, e posteriormente os outros, então, uma a uma as frações são coletadas e seus solutos analisados quantitativamente.
Há também a Cromatografia líquida de alto desempenho, que é uma melhoria moderna, com resinas mais fortes e aparelhamento aperfeiçoado que obtém melhores e mais rápidas separações. O processo se dá automaticamente em um aparelho chamado analisador de aminoácidos.

b)-Cromatografia de exclusão por tamanho
Este método - também conhecido como filtração em gel – separa proteínas (ou outras substâncias, como carboidratos) conforme o tamanho das moléculas. A coluna contém esferas de um polímero poroso, sendo assim, quando a mistura proteica é adicionada as moléculas maiores passam mais rapidamente e aparecem nas primeiras frações pois não penetram nos poros das esferas devido ao tamanho; já as menores, penetram pelos poros e demoram mais a migrar.

c)-Cromatografia de afinidade
Esta técnica separa as proteínas por sua especificidades de ligação. A coluna contém um polímero ao qual está unido um ligante específico para a proteína que interessa. Assim, quando se adiciona a mistura de proteínas à coluna as proteínas indesejadas são transportadas pelo líquido eluente, e ficam retidas somente as proteínas que interessam unidas aos ligantes das esferas de polímero. Então esta proteína de interesse é eluída por uma solução contendo o ligante livre.

d)-Cromatografia em Papel
A cromatografia em papel, apesar de haver técnicas mais modernas, é ainda usada na separação de aminoácidos.
Aplica-se a amostra a 5 cm da extremidade da tira de papel de filtro. Essa tira é suspensa em um recipiente hermeticamente fechado, que contém o solvente cromatográfico.
Os solventes para separação de misturas de aminoácidos são misturas de água, álcoois, ácidos ou bases. Quando a migração do solvente chegar até quase ao fim da fita, esta é seca e tratada para permitir a visualização das moléculas de interesse. Há também a cromatografia em papel bidimensional, em que utiliza-se uma folha de papel quadrado ao invés da tira. E o papel é cromatografado em duas misturas de solventes.

2)-Electroforese
Eletroforese é o movimento de solutos carregados eletricamente em resposta à aplicação de um campo elétrico; freqüentemente é usada para separar misturas de íons, proteínas e ácidos nucleicos.

A eletroforese na separação de proteínas
A eletroforese, em adição à cromatografia, é um processo importante para separar proteínas. Neste caso a separação se dá por migração de moléculas em um campo elétrico. Porém, há o incoveniente de geralmente este método inativar as proteínas. As vantagens são que as proteínas são separadas e visualizadas, e permitir a determinação de propriedades cruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e seu peso molecular aproximado.

A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida, que funciona como uma peneira molecular reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporção aproximada à massa, ou peso molecular, de cada uma delas.

Para determinar-se a pureza e o peso molecular de proteínas um método utilizado faz uso do detergente dodecilsulfato (SDS); este liga-se a maioria das proteínas em quantidades proporcionais ao peso molecular de cada proteína, geralmente uma molécula de SDS para dois resíduos de aminoácidos. Quando o SDS se liga as proteínas a conformação destas é alterada e a maioria adquire a mesma forma, por isso passam a ter a mesma relação entre carga elétrica e massa. Então a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase que exclusivamente por seu peso molecular, sendo que os polipeptídeos menores migram mais rápido. Após a eletroforese as proteínas podem ser visualisadas com um corante como o Azul de Coomassie que se une a elas mas não ao gel.

Eletroforese Bidimensional
É a combinação de dois métodos – a eletroforese em SDS (Sódio Dodecil Sulfato) e a focalização isoelétrica – em géis bidimensionais; conseguindo-se assim a resolução de misturas complexas de proteínas.

A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o ponto isoelétrico (pI) de uma proteína, estabelece-se um gradiente estável do pH no gel através da aplicação de um campo elétrico, então adiciona-se a solução proteica e o campo elétrico é reaplicado, e assim cada proteína migra até atingir o pH que é igual ao seu pI.

A eletroforese bidimensional separa as proteínas de peso molecular idêntico, que diferem em seu pI, ou proteínas com pI similar, porém com peso molecular diferentes. Usa-se primeiramente a focalização isoelétrica, no sentido vertical (coluna) e depois a eletroforese com SDS no sentido horizontal (placa de gel); assim cada sentido indica uma diferença o pI ou o peso molecular.

Espectrometria de massa
É um método para identificar os diferentes átomos que compõe uma substância. Um espectrômetro de massa bombardeia uma substância com elétrons para produzir íons, ou átomos eletricamente carregados. Os íons atravessam um campo magnético que curva suas trajetórias de modos diferentes, dependendo de suas massas. O campo separa os íons em um padrão chamado espectro de massa. A massa e a carga dos íons podem ser medidas por sua posição no espectro. Os cientistas identificam assim os elementos e isótopos presentes na amostra. Para as proteínas, esse método serve principalmente para determinar o peso molecularda proteína e assim contribuir para a sua identificação e caracterização.

PCR (Reação em cadeia da polimerase)

Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.

Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de dianóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para detecção de agentes patogênicos e etc.

Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR

Aplicações
O PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. etc O PCR também é utilizado na paleontologia para o sequenciamento genico de animais pré-históricos.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três grupos fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2^ciclos

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.

Nested PCR
Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externamente para a 1 reação(round) e outro interno ao produto do 1 round. A reacção de 1 round necessita de um maior tempo de extensao devido ao maior produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota do 1 round,que servira de alvo, ao mix de 2 round O produto de 1 round normalmente não é evidenciado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto de 2 round gera grande quantidade de produto e por isso pode ser utilizado na corrida ou para o sequenciamento

A placa contendo o mix e o DNA alvo é "ativado" quando a temperatura atingir 94 graus. Esse procedimento aumenta a especificidade pois a polimerase contem um anticorpo, este anticorpo denatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94. Polimerases que nao possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejado(inespecificos)em temperatura ambiente

ÁGUA E SOLUÇÕES (2)

SOLUÇÕES

Conceito – Uma solução é uma mistura homogénea de duas ou mais substâncias, em que os seus componentes estão misturados a nível molecular. Os componentes de uma solução, são:

1. O soluto, que é a substância que existe em menor quantidade.
   
2. O solvente, que é a substância que existe em maior quantidade.
   

Classificação - As soluções podem ser:

• Sólidas . Como exemplo desse tipo de soluções temos as ligas metálicas ou os materiais básicos da indústria electrónica, constituídas por silício e pequenas quantidades de fósforo.
  
• Gasosas. Como exemplo temos o ar que respiramos.
  
• Líquidas. Há muitos exemplos de soluções líquidas sendo o mais abundante a água do mar. As soluções líquidas por sua vez, podem ser do tipo:
  
  • Sólido-líquido
    
  • Líquido-líquido
    
  • Gás-líquido.
    

A maior parte das reacções químicas dá-se em em soluções líquidas, provávelmente devido á maior mobilidade das susbstâncias nestes meios, podendo reagir entre si mais rápidamente. Os químicos usam tanto os solventes aquosos como os não aquosos, mas para os bioquímicos o meio por excelência é a água. Por isso, daremos mais atenção às soluções aquosas, não só por a água ser o líquido mais abundante na natureza, como pelo facto de que muito do que se pode dizer para as soluções aquosas, é igualmente válido para os solventes não aquosos.

Os solutos em solução aquosa, podem ser classificados em electrólitos e não electrólitos.

• Electrólito: um electrólito é uma substância que quando dissolvida na água se dissocia em iões com carga eléctrica, produzindo uma solução capaz de conduzir a corrente elétrica. Os electrólitos por sua vez, classificam-se em fortes e fracos.
  
  • Um electrólito forte, dissocia-se nos seus iões, em solução aquosa, se a sua concentração não for muito elevada. Se a concentração dos iões for muito elevada, estes têem tendência a interactuar uns com os outros formando associações iónicas. Nos sistemas biológicos em que as concentrações dos sais são baixas, os electrólitos fortes, podem considerar-se totalmente dissociados. Exemplo de electrólitos fortes são o NaCl ou o KNO₃.
    
  • Os electrólitos fracos são substâncias que não se dissociam completamente, sendo as percentagens de dissociação função das respectivas constantes de equilíbrio. Por exemplo, o ácido acético (CH₃COOH) só se dissocia parcialmente nos seus iões (HO₃+ e acetato), ou amónia (NH₄OH), que também se dissocia só parcialmente em ião amónio (NH₄+) e ião hidróxido (OH-).
    
  • Os açúcares ou os álcoois que se dissolvem fácilmente em água, mas que não possuem carga eleétrica nem se dissocam em espécies com carga, são classiciados como não-electrólitos.
    

O processo de dissolução pode ser decomposto nos seguintes passos:

1. Separação das partículas do soluto, vencendo as forças de atração soluto-soluto.
   
2. Introdução das partículas do soluto no meio do solvente, vencendo as forças de interação solvente-solvente.
   
3. Solvatação das moléculas do soluto pelas do solvente. Chama-se de solvatação ao processo pelo qual um ião ou molécula fica rodeado por moléculas do solvente dispostas de maneira definida. Quando o solvente é a água, o processo desigana-se por hidratação.
   

De modo geral, pode dizer-se que igual dissolve igual, ou seja, os compostos químicos tendem a dissolver-se em solventes que lhes sejam químicamente semelhantes: solutos polares dissolvem-se em solventes polares, enquanto que os solutos não polares dissolvem-se em solventes não polares. Esta regra reflete o facto de que para a solubilização se dar é necessário que algumas das interacções entre moléculas de soluto e algumas interações entre as moléculas do solvente sejam substituídas por interações formadas entre o soluto e o solvente. Se estas interações forem do mesmo tipo, pouca energia será necessária para a dissolução.

A solubilidade de um composto depende assim da competição entre as moléculas do solvente e os iões do soluto, tentando separá-los, e os iões do soluto entre si, tentando regenerar o cristal. Será então de esperar que todos os factores que influenciam a energia reticular dos solutos, a energia de interacção soluto-solvente e a energia de interação entre os iões em solução, afetarão a solubilidade dos respectivos compostos, nomeadamente a carga, o raio e a configuração electrónica dos iões.

No entanto, não são só as energias de interação que determinam as solubilidades. Estas energias contribuem para a variação da entalpia, ΔH, mas as variações da entropia ΔS, são igualmente importantes. Ambas concorrem para a variação da energia livre de Gibbs, ΔG. O processo de dissolução é sempre acompanhado por um aumento da desordem. Tanto o soluto como o solvente possuem uma certa ordem, no estado puro. Esta ordem é destruída quando o soluto se dissolve no solvente. Este aumento da desordem favorece o processo de dissolução.

Soluções de líquidos em líquidos

Quando se mistura etanol em água há dissolução completa de um no outro, em todas as proporções, por isso se dizem líquidos miscíveis. No caso do etanol e da água, a dissoulução verifica-se porque a interacção soluto-solvente se faz através de ligações hidrogénio, comparáveis às que se estabelecem entre as moléculas de água por um lado, e as moléculas de etanol, por outro. Por razões ideênticas, o tetracloreto de carbono (CCl₄) se dissolne fácilmente em benzeno (C₆H₆), porque as forças intermoleculares que se estabelecem entre estas duas são forças de London, exactamente do mesmo tipo das existentes em cada uma das moléculas, separadamente. Pelo contrário, o benzeno não é miscível em água (isto é, os dois líquidos não se misturam), porque as forças atractivas entre a água e o benzeno são do tipo dipolo induzido (forças de Keesom) e de London, que são muito mais fracas que as ligações pontes de hidrogénio que se estabelecem entre as moléculas de água e que as forças de London que se estabelecem entre as moléculas de benzeno.

Soluções de sólidos em líquidos

Em geral, os compostos iónicos e os moleculares dissolvem-se em certos solventes, mas os metais e muitos sólidos covalentes com estrutura em rede, não se dissolvem em nenhum solvente.

1. Compostos iónicos – Em geral, os compostos iónicos são mais solúveis em solventes polares (dissolução de NaCl em água), como a água ou o amoníaco, do que em solventes não polares, como o benzeno ou clorofórmio. Como a solubilidade dos compostos iónicos em água, é regidas pela lei de Coulomb, são mais solúveis os iões de menor carga e maior tamanho. Os iões fosfato (PO₄^3-) que têm carga fortemente negativa (-3), são fortemente atraídos pelos catiões do sólido, e a sua solubilidade em água é baixa, o que é uma vantagem para os animais cujo esqueleto é básicamente formado por fosfato de cálcio [Ca₃(PO₄)₂], mas é um inconveniente para a agricultura, devido á dificuldade em usar sais de fosfato como fertilizante. A solubilidade dos sais de fosfato pode ser aumentada, transformando-os em hidrogenofosfato (HPO₄²), que por terem carga -2, já são muito mais solúveis.
2. Composto moleculares – São compostos em que entre as suas moléculas se exercem interacções do tipo van der Waals e, em certos caso, ligações de hidrogénio. Vimos, por exemplo, que iodo (I₂) se dissolve em solventes não polares e a sua solubilidade em água é muito baixa. Também as gorduras, que são misturas de compostos formados por longas cadeias de hidrocarbonetos, se dissolvem bem em benzeno e outros solventes não polares, mas não em água. No dióxido de carbono (CO₂), cada ligação C=O é polar mas os dois dipolos têem direcções opostas e anulam-se. Estes gazes são então pouco solúveis em água. Certos organismos (como o homem) possuem proteínas solúveis que transportam ou armazenam o CO₂, como a hemoglobina e a mioglobina. O dióxido de carbono produzido por processos metabólicos difunde-se para os eritrócitos, onde é convertido em H₂CO₃, pela anidrase carbónica.
3. Compostos anfipáticos – São compostos que têm uma parte polar e outra parte apolar. O exemplo desse tipo de composto são os sabões, que são formados por uma longa cadeia carbonada hidrofóbica, que se chama cauda, e uma parte constituída por um grupo carboxilato (-CO₂^-), que se chama cabeça, e que é hidrofílica. Nos detergentes actuais se adicionam compostos com esta dupla função, a que se chamam de surfactantes. Compostos desse tipo são muito eficazes na remoção da gordura, devido á sua dupla função: Por um lado a cadeia de hidrocarbonetos de cada molécula penetra nas gordura, enquando que a cabeça hidrofílica interactua com a moléculas de água, fazendo com que toda a mancha de gordura possa dissolver-se na água. Quando em concentrações mais elevadas, os detergentes formam micelas, que são pequenos agregados em que as cabeças das moléculas estão viradas para a água e as caudas ficam no interior da gordura.
   

1. De maneira geral, as regiões não polares dos compostos anfipáticos tendem a constituir agregados de forma a apresentar uma área hidrofóbica o mais pequena possível ao solvente, e as regiões polares tendem a arrnajar de forma a maximizar as suas interações com o solvente. Quando dispersas na água, estas susbstâncias formam monocamadas, micelas ou bicamadas, dependendo da concentração e de outros factores.
   

Muitas moléculas biológicas são anfipáticas: proteínas, pigmentos, algumas vitaminas e ainda os esteróides e fosfolipídeos da membrana. Os agregados estruturais formados por estas moléculas são estabilizados por interacções hidrofóbicas nas suas partes não polares. As interações hidrofóbicas entre os lípidos, e entre os lípidos e proteínas, são fundamentais na estruturas biológicas da membranas. As membranas celulares adoptam uma disposição em bicamada.

Soluções verdadeiras, suspensões e soluções coloidais

Solução saturada – Chama-se solução saturada, a uma solução que contenha uma máxima quantidade de soluto, num dado solvente, a uma temperatura determinada. Antes de se atingir o ponto de saturação, a solução diz-se insaturada. Quando as soluções contêm uma quantidade de soluto maior de uma solução saturada, chamam-se sobressaturadas.

Solubilidade: É a quantidade máxima de um soluto que se pode dissolver numa determinada quantidade de solvente, a uma dada temperatura. Uma solução saturada, representa então a capacidade limite de um soluto de se dissolver numa dada quantidade de solvente.

Solubilidade molar: de uma dada substância, é a concentração da sua solução saturada, expressa em molaridades.

Quando as substâncias são pouco soluúveis e a solubilidade é excedida , dá-se a precipitação ficando os iões da parte dissolvida, em equilíbrio com o material no estado sólido (precipitado). Este equilíbrio é dinâmico, o sólido continua a dissolver-se, mas a velocidade a que se dissolve é exactamente igual á velocidade a que o soluto volta ao estado sólido.

Soluções coloidais: O tamanho das partículas de um sólido formado por precipitação, varia muito. Num dos extremos, estão as supensões coloidais, cujas partículas possuem um diâmetro que varia entre 10-7 a 10-4 cm, são invisíveis a olho nu, e as partículas sólidas, não têem qualquer tendência a depositar-se. No outro extremo, estão partículas cuj dimensões estão na ordem da décima de milímetro, cuja dispersão temporária se chama de suspensão cristalina.

CONCENTRAÇÃO DAS SOLUÇÕES

Espressão das concentrações: A concentração das soluções, são a forma de exprimir em unidades de grandeza o número relativo de moléculas de soluto e de solvente. Na tabela abaixo, resumem-se as várias unidades de concentração que normalmente se usam em química. Embora seja útil conhecermos todas, as mais importantes saão fracção molar, a molalidade, a molaridade e a percentagem (muito usada em soluções farmacológicas).

Fracção molar (x) – É a razão entre o número d moless de um componente de uma mistura e o número total de moles de todos os componentes de uma mistrura. Para o caso de um soluto dissolvido numa solução de não electrólito:

Molaridade(M) – Também chamada de concentração molar. É uma maneira muito corrente de expressar a concentração das soluções. Ela é definida como o número de moles de soluto dividido pelo volume da solução. Representa-se por M.

Molalidade (m)- É o número de moles de soluto numa solução dividido pela massa de solvente em quilogramas. Representa-se normalmente pela letra m.

Figura 1: Propriedades da água.

ÁGUA E SOLUÇÕES

Água e Soluções

Figura: Representação esquemática de uma molécula de água, com a descrição das suas propriedades mais importantes.

A água está intimamente relacionada com a vida, intervindo em práticamente todas as reacções químicas da célula. Toda a evlução dos seres vivos se desenvolveu numa dependência constante das suas propriedades químicas.

As propriedades da molécula de água, têm consequências diretas no comportamento das biomoléculas. Os compostos polares, tendem a dissolver-se porque estabelecem interacções com a água, nomeadamente por pontes de hidrogénio.

Embora os compostos bioquímicos sejam em grande medida formados por cadeias de carbono e hidrogénio não polares, muitos deles contêem na sua estrutura grupos polares ,como por exemplo os seguintes grupos funcionais:

1. Grupo carbonilo ( C = O).
2. Oxidrilo (-OH).
3. Carboxilo (-COOH)
4. Amina (-N-).
5. Amida (H₂N – C=O).
6. Éster (-COO-R).
7. Grupos derivados do ácido fosfórico ( HPO₃^2-).
   Etc.
   

A presença desses grupos determina, de imediato, não só o estabelecimento de ligações com as moléculas de água, como a possibilidade de reacções de hidrólise, protólise e de hidratação. Por outro lado, a intensidade dessas interações e a expansão dessas reacções dependem mínimamente do pH. Por isso, nos organismos vivos, o pH tem de ser rigorosamente controlado.

Logo, nos organismos vivos, os processos bioquímicos ocorrem em meio aquoso e a vida da célula depende de um controle rigoroso do seu pH interno, que depende da solubilidade de determinados compostos na água. Logo, há noções que é indespensável entender, como sejam as propriedades da água, a solubilidade e o pH.

ESTRUTURA E PROPRIEDADES DA ÁGUA

A molécula de água isolada, pode representar-se do seguinte modo:

Esta estrutura permite compreender o forte carácter polar da molécula de água. A molécula tem uma elevada densidade de carga negativa junto ao átomo de oxigénio e uma elevada densidade de carga positiva junto dos átomos de hidrogénio, o que lhe confere um carácter dipolar. Esse carácter dipolar é o responsável pelas propriedades peculiares da água no estado líquido. A região da molécula carregada positivamente tende a orientar-se em direcção á região da outra molécula vizinha, que possua carga positiva, formando assim uma ligação de hidrogénio.

a)- Pontes de hidrogénio: É uma ligação fraca (não covalente) mas é a mais forte das ligações fracas. É um tipo de ligação abundantemente representadao nos sistemas biológicos (aquosos).
Nesta ligação, um átomo de hidrogénio é partilhado por dois outros átomos. Aquele a que o H está mais fortemente ligado é chamado de dador de hidrogénio, enquanto que o outro é o aceitador de hidrogénio.

O dador, em sistemas biológicos, é um átomo de oxigénio(O) ou de azoto (N) ligado de forma covalente a um hidrogénio (H). O aceitador é possuidor de uma carga parcial negativa (traduzida por um par não partilhado de electrões), que atrai o hidrogénio (em sistemas biológicos pode ser o oxigénio, o azoto. Em sistemsa não biológicos, também pode ser o flúor).
As energias de ligação variam entre 3 a 7 calorias por mole (3-7 Kcal.mol^-1)

A polaridade da água, bem como a sua capacidade de formar fácilmente pontes de hidrogénio, fazem com que seja uma molécula com propriedades muito pouco vulgares: Tem um ponto de ebulição muito alto (100°C), quando comparado a outros compostos (p.e. do metano = -89°C). As pontes de hidrogénio também responsáveis por outras propriedades de outros compostos: Por exemplo certos alcoois, são líquidos a temperaturas relativamente elevadas (metanol é líquido a 64° C), enqunqto que os éteres correspondentes, são gases. O gelo tem um ponto de fusão muito alto, a água líquida tem uma densidade máxima por volta dos 4°C, o que não coincide com o ponto de fusão (figura).

Estas ligações são também responsáveis em parte, pela solubilidade na água dos alcoois e ácidos carboxílicos, de massa molar mais baixa. A água é um excelente solvente para sais e moléculas polares e tem uma constante dielétrica mais elevada do que a de qualquer outro líquido.

Um exemplo da importância das pontes de hidrogénio é a dupla hélice do DNA, que é estabilizada por pontes de hidrogénio entre as bases azotadas de cadeias opostas. Estas forças são também envolvidas na estabilização da estrutura terceária das porteínas e, juntamente com as forças de van der Waals, na ligação da enzima ao substrato.

b)- Forças de van der Waals: A justificação para a existência destas forces atractivas , muito fracas e não específicas, é o facto de a distribuição da carga electrónica de um átomo variar no tempo, podendo num dado instante não ser perfeitamente simétrica; donde mesmo numa molécula simétrica, os electrões que a envolvem não estarem simétricamente distribuídos, produzindo um dipolo temporário muito fraco que pode induzir outros dipolos nas moléculas vizinhas.
Todas estas interacções produzem actrações intermoleculares designadas forças de van der Walls, que são as grandes responsáveis pelas interações entre moléculas apolares.
Apesar de muito fracas (energia de interacção é 1 Kcal.mol^-1), este tipo de ligação torna-se significativo se numerosos átomos de uma molécula puderem aproximar-se de um número elevado de átomos de outra molécula.
As forças de van der Waals explicam também, por exemplo a solubilidade do Cl₂ na água: A molécula do cloro é simétrica e apolar, no entanto consegue estabelecer um relacionamento com as moléculas de água porque estas induzem nela pólos instantâneos, de modo que que as interacções entre o Cl₂ e a água, fracas mas numerosas, são suficientes para determinar a dissolução.
Nos compostos biológicos, estas ligações contribuem para a estrutura terceária das proteínas; para a ligação do centro activo de determinadas enzimas ao substrato e na manutenção da fluidez das membranas biológicas. Por exemplo, nas membranas celulares, as moléculas de fosfolipídeos, com cadeias hidrocarbonadas longas, estão associadas por forças de van der Waals.

Importância biológica da água: A água é a asubstância mais abundante nos sistemas vivos, constituindo mais de 70% do peso de muitos organismos. A vida na terra depende de forma crítica das propriedades da água, nomeadamente a capacidade de dissolver bem as moléculas polares, que podem servir como alimentos, catalizadores ou transmissores de informações. Todas as células biológicas dependem do meio exterior para nutrientes, que lhes são necessários, para o seu crescimento, ou para fornecimento de energia. Todos os aspectos da estrutura e função das células e suas funções são adaptados às propriedades físicas e químicas da água. A composição do meio exterior pode variar muito mas, as células possuem mecanismos variados para ultrapassar essas variações. Além disso os compartimentos intracelulares também têem diferentes composições químicas e bioquímicas. A característica comum a todos estes meios é a presença da água. A água é o solvente onde estão dissolvidas, ou em suspensão as substâncias necessárias à célula.
Métodos de purificação da água

A água na natureza não se encontra na forma pura. Ele contém sempre uma variedade de solutos e microorganismos dos quais deve ser separada, para que se torne própria para o consumo humano (água potável) e para ensaios laboratoriais. Para o consumo humano são usados métodos mais ou menos grosseiros de purificação, tais como a decantação, a floculação e a filtração, que já são do nosso conhecimento. Contudo, para o uso no laboratório, as exigências do grau de pureza da água são muito maiores e dependem muito do fim a que a água se destina.

Os processos mais comunmente usados para obter água própria para uso laboratorial são:

1. Destilação
2. Troca iónica
3. Osmose inversa
4. Adsorção por carbono activado
5. Filtragem microporosa
6. Ultrafiltragem
7. Foto-oxidação

Destilação

A destilação é um processo há muito estabelecido para a purificação da água, no qual a água é aquecida até evaporar e o vapor é condensado e recolhido. O equipamento é relativamente económico, mas tem um grande consumo de energia – usa tipicamente 1kW de electricidade por litro de água produzida. Dependendo do design do destilador, a água destilada pode ter uma resistividade de aproximadamente 1 MΩ-cm e será estéril quando acabar de ser produzida se for utilizado equipamento especificamente concebido para o efeito, mas não continuará estéril sem um armazenamento muito cuidadoso. Para além disto, impurezas voláteis como dióxido de carbono, sílica, amoníaco e uma variedade de compostos orgânicos passarão para a água destilada.
Quais são as desvantagens da destilação?
A destilação produz água purificada lentamente. Por este motivo, é necessário destilar uma determinada quantidade de água e armazená-la para utilizar mais tarde. Este armazenamento da água destilada pode constituir um problema se o reservatório em que a água é armazenada não for fabricado num material inerte. Os iões ou plastificantes poderão se destacar do reservatório e recontaminar a água. Para além disto, as bactérias desenvolvem-se muito bem em água que esteja parada durante algum tempo.

Para manter a esterilidade, são usadas garrafas de armazenamento estéreis e a água recolhida é colocada num autoclave, mas uma vez aberta a garrafa fica exposta a bactérias e a contaminação começa. Em áreas de água dura, os destiladores tem de ser limpos frequentemente com ácido, devido à acumulação de incrustações, a não ser que a água de alimentação seja pré-tratada por amaciamento ou osmose inversa.

Troca iónica
A troca iónica é muito usada em laboratórios para fornecer água purificada conforme necessária. Os desionizadores de laboratório possuem invariavelmente cartuchos cheios de resinas com cargas negativas e positivas (mistas) que servem para a troca iónica que após o seu uso numerosas vezes, ou são devolvidos a uma estação de regeneração para recarregar, ou então são descartados. Aniões e catiões presentes na água a ser tratada, são removidos pelas resinas de troca iónica e substituídos por iões de hidrogénio e hidróxilo da resina. Os iões de hidrogénio e de hidróxilo combinam-se para formar outras moléculas de água.

Como funciona a troca iónica?
A troca iónica troca iões de hidrogénio por contaminantes catiónicos e iões de hidróxilo por contaminantes aniónicos presentes na água de alimentação. Os leitos de resinas de troca iónica são constituídos por pequenos grânulos esféricos através dos quais passa a água de alimentação. Ao fim de algum tempo, os catiões e aniões terão substituído a maior parte dos pontos de hidrogénio e hidróxilo activos nas resinas e os cartuchos necessitarão de ser substituídos ou regenerados.

Quais são as vantagens da troca iónica?

A troca iónica tem muitas vantagens relativamente à destilação no que respeita à produção de água purificada:

1. Em primeiro lugar, é um processo de resposta a pedido; a água fica disponível quando é necessária.
2. Em segundo lugar, quando se usam materiais de resina de elevada pureza, efectivamente, todo o material iónico é removido da água para dar uma resistividade máxima de 18,2 MΩ-cm (a 25ºC).

Pequenos fragmentos dos materiais de resina de troca iónica podem ser expelidos do cartucho pela água que passa através do mesmo. A troca iónica deve, portanto, ser usada juntamente com filtros se se desejar uma água isenta de partículas. Dado que as bactérias se desenvolvem rapidamente em água parada, os cartuchos podem ficar contaminados se não forem regularmente usados. O problema é atenuado pela recirculação frequente da água para inibir o desenvolvimento de bactérias e pela substituição ou regeneração regular das resinas, dado que os químicos regenerantes são desinfectantes poderosos.

A troca iónica remove apenas compostos orgânicos polares da água e os orgânicos dissolvidos podem sujar os grânulos de troca iónica, reduzindo a sua capacidade. Quando é necessária água pura em termos orgânicos e inorgânicos, a combinação de osmose inversa seguida de troca iónica é especialmente efectiva.

Tem havido muitas tentativas de ultrapassar algumas das limitações da troca iónica e da destilação. Nalguns sistemas, a destilação precedia a troca iónica – os cartuchos duram muito mais, mas o problema das bactérias mantém-se. Noutros, a troca iónica precedia a destilação – mas nesse caso mantêm-se os problemas de armazenamento e de não ter água a pedido.

Electrodesionização

A electrodesionização (EDI) é um processo de purificação conduzido electricamente e oferece uma combinação de resina de troca iónica e membranas selectoras de iões. A EDI, que é geralmente associada à osmose inversa, oferece uma alternativa útil a outros métodos de purificação. Proporciona água reagente para laboratório em grandes volumes sem a necessidade de cartuchos de desionização. Esta abordagem evita a redução na qualidade da água produzida associada a cartuchos à medida que estes vão ficando exaustos, bem como os custos associados à substituição dos cartuchos.

Como funciona a electrodesionização?

A EDI desenvolveu-se a partir da electrodiálise (ED). O princípio da ED é que a água é purificada numa célula que contém dois tipos de membranas selectoras de iões – permeáveis a catiões e permeáveis a aniões – colocadas entre um par de eléctrodos. Quando é aplicado um potencial eléctrico directo através da célula, os catiões presentes na água são atraídos para o cátodo com carga negativa e os aniões são atraídos para o ânodo com carga positiva. Os catiões podem atravessar a membrana permeável a catiões, mas não a membrana aniónica. Da mesma forma, os aniões podem atravessar a membrana permeável a aniões, mas não a membrana catiónica. O resultado é a movimentação de iões entre as câmaras e a água numa secção pode ficar desionizada enquanto a água que se encontra noutra secção fica concentrada.

Na prática, a ED só pode ser usada economicamente para produzir água de condutividade relativamente alta (200 µS/cm ou superior) dadas as tensões eléctricas proibitivamente altas que são necessárias para movimentar os iões numa água cada vez mais pura.

Este problema é resolvido na tecnologia EDI preenchendo os espaços entre as membranas com resinas de troca iónica. As resinas proporcionam uma via de fluxo condutivo para a migração dos iões, permitindo que a desionização seja praticamente completa e resultando na produção de água de elevada pureza. Outra vantagem da EDI consiste no facto de que a electrólise contínua da água que ocorre na célula produz iões de hidrogénio e de hidróxilo. Estes iões mantêm as resinas num estado altamente regenerado, evitando assim a necessidade de reactivação química. As resinas usadas nos sistemas EDI podem consistir em câmaras separadas de grânulos de aniões ou catiões, camadas de cada um dos tipos numa única câmara ou uma mistura íntima de grânulos de catiões e de aniões.

Tipicamente, a água produzida tem uma resistividade de 10-18 MΩ-cm (a 25°C) e um teor de carbono orgânico total inferior a 20 ppb. Os níveis bacterianos são minimizados porque as condições químicas e eléctricas existentes dentro do sistema inibem o desenvolvimento de microorganismos.

A EDI complementa muito eficazmente a osmose inversa. A OI é um processo baseado na pressão no qual a água perde os seus contaminantes à medida que passa através da membrana. Não elimina, contudo, todas as espécies iónicas e não pode remover contaminantes dissolvidos como o dióxido de carbono. A EDI remove o dióxido de carbono e também outras espécies fracamente ionizáveis, tais como a sílica, ionizando-as e fazendo-as passar através da membrana.
Para se obter água do mais alto grau de pureza, que pode ser usada por exemplo em aparelhos de HPLC (High Pressure Liquid Cromatography) utiliza-se o processo de passagens múltiplas no qual a água de alimentação pré-purificada por osmose inversa passa por um leito de troca catiónica, um leito de troca aniónica e um leito de resinas mistas é análogo a muitos sistemas de purificação de água de elevada pureza em grande escala.

Osmose inversa

A osmose inversa (OI) é um processo que resolve muitos dos problemas da destilação e da troca iónica. Para explicar a osmose inversa, vejamos primeiro a osmose. Este é um processo natural que ocorre sempre que uma solução diluída é separada de uma solução concentrada por uma membrana semi-permeável. A água, levada por uma força causada pela diferença na concentração – a pressão osmótica – passa através da membrana para a solução concentrada. O fluxo de água continua até a solução concentrada ficar diluída e a contra-pressão impedir a continuação do fluxo através da membrana (equilíbrio osmótico).

A osmose inversa ou osmose reversa é um processo de separação em que um solvente é separado de um soluto de baixa massa molecular por uma membrana permeável ao solvente e impermeável ao soluto. Isso ocorre ao se aplicar uma grande pressão sobre este meio aquoso, o que contraria o fluxo natural da osmose. Por essa razão o processo é denominado osmose reversa.
Em osmose inversa, as membranas retêm partículas cujo diâmetro varia entre 1 e 10 Å(2). As partículas retidas são solutos de baixa massa molecular como sais ou moléculas orgânicas simples. Por este motivo, a osmose é aplicada a processos como a dessalinização da água do mar ou a recuperação de águas residuais na indústria.
Como as partículas são muito pequenas, a pressão osmótica das soluções é elevada. Para que a velocidade de permeado seja razoável, a diferença de pressão hidrostática através da membrana tem que ser elevada, atingindo valores entre 3 e 100 atm(2), dependendo do tipo de aplicação.

Quando é aplicada uma pressão superior à pressão osmótica no lado da membrana onde se encontra a maior concentração, o sentido normal do fluxo osmótico é invertido, a água pura passa da solução concentrada através da membrana e é assim separada dos seus contaminantes. Este é o princípio básico da osmose inversa (às vezes chamada hiperfiltração).

Na prática, a água de alimentação é bombeada para um recipiente sob pressão que contém uma espiral ou um conjunto de fibras ocas de membranas semi-permeáveis. A água purificada passa através da membrana para formar o "permeato". Os contaminantes ficam acumulados na água residual, chamada o "concentrado", que é escoada continuamente para a conduta de drenagem. A geração mais recente de membranas de osmose inversa em compósito de película fina de poliamida que substituíram as membranas celulósicas mais antigas remove 95-98% de iões inorgânicos, juntamente com praticamente todos os contaminantes não iónicos e moléculas orgânicas grandes com um peso molecular superior a 100. Os gases dissolvidos não são removidos.
Devido a esta excepcional eficiência purificadora, a osmose inversa é uma tecnologia muito eficiente em termos de custo para um sistema de purificação de água. É, no entanto, limitada pela velocidade de produção relativamente lenta e é, portanto, normalmente usada para encher um reservatório antes da utilização ou de mais purificação. A osmose inversa tende a proteger o sistema de bactérias e pirogénios. É muitas vezes combinada com a troca iónica para melhorar consideravelmente a qualidade da água produzida.
Meios de adsorção
O carvão activado, preparado por pirólise de cascas de coco, carvão ou grânulos de resina, remove o cloro através de um mecanismo catalizador e os orgânicos dissolvidos por adsorção e encontra-se frequentemente em dois locais num sistema de purificação de água. O carvão pode ser usado sob a forma de grânulos ou, mais convenientemente, sob a forma de bloco. Dado que as membranas de osmose inversa em compósito de película fina podem ser danificadas por exposição excessiva ao cloro livre e, em menor escala, sujas por orgânicos dissolvidos, o carvão activado é muitas vezes colocado antes da membrana OI para remover estes contaminantes.

São também muitas vezes colocados filtros de carvão activado no circuito de polimento de um sistema de purificação de água para remover vestígios de orgânicos dissolvidos antes da troca iónica final.

Filtragem microporosa

As membranas de filtragem microporosa opõem uma barreira física à passagem de partículas e microorganismos e têm classificações nominais absolutas até 0,1 mícron; alguns sistemas ELGA incorporam também "filtros ultramicro" com uma classificação nominal de 0,05 mícron. A maior parte das águas não tratadas contém colóides, que têm uma ligeira carga negativa (medida pelo potencial Zeta). O desempenho dos filtros pode ser melhorado utilizando microfiltros que incorporam uma superfície modificada que atrai e retém esses colóides que ocorrem naturalmente, que são geralmente de dimensões muito inferiores às dos poros da membrana. São muito usados em sistemas de tratamento de água microfiltros com um diâmetro absoluto dos poros de 0,2 mícron. Estes filtros recolhem contaminantes, incluindo finos de carvão provenientes de cartuchos de adsorção de orgânicos, partículas de resina de cartuchos de troca iónica e bactérias.

O filtro sub-mícron pode ser instalado na torneira de forma a que o último filtro que a água atravesse antes de ser usada seja o filtro sub-mícron.

Uma alternativa consiste em incluir o filtro sub-mícron no circuito de recirculação para remover continuamente as bactérias da água purificada. Os filtros sub-mícron devem também ser colocados em pontos de utilização críticos para uma protecção absoluta e para impedir a recontaminação do sistema por bactérias que entrem por essa via.

As membranas microporosas são geralmente consideradas indispensáveis num sistema de purificação de água, a não ser que sejam substituídas por um ultrafiltro.

Ultrafiltragem

A ultrafiltragem utiliza uma membrana muito semelhante na sua concepção à da osmose inversa, exceptuando que os poros do ultrafiltro são ligeiramente maiores, de 0,001 a 0,02 mícron. Para a remoção de pirogénios, os poros de um ultrafiltro devem ter um diâmetro de aproximadamente 0,002 mícron ou inferior e devem excluir todas as moléculas com um peso molecular de 5.000 ou mais.

Os ultrafiltros podem ser usados de forma semelhante à das membranas microporosas, mas também podem ser instalados de forma a permitirem que uma pequena porção da água de alimentação passe tangencialmente pela membrana para minimizar a acumulação de contaminantes e o desenvolvimento de bactérias. A ultrafiltragem é uma tecnologia excelente para assegurar a qualidade contínua da água ultrapura no que toca a partículas, bactérias e pirogénios.

Foto-oxidação

A foto-oxidação usa radiação ultravioleta de grande intensidade para destruir bactérias e outros microorganismos e para separar e ionizar quaisquer compostos orgânicos para posterior remoção por cartuchos de troca iónica. A radiação com um comprimento de onda de 254 nm é a que tem uma maior acção bactericida, enquanto a radiação com comprimentos de onda mais curtos (185 nm) é mais eficiente para a oxidação de orgânicos.

CONTROLE DE QUALIDADE DA ÁGUA REAGENTE

Qualidade de Água Reagente: As especificações para água reagente em laboratórios são várias dependendo da aplicação, por isso é fundamental conhecer os tipos e qual o processo analítico deve utilizar a mesma.
A água purificada é um íten indispensável em Organizações Cientificas, Industrias, Matéria Prima na Produção de medicamentos, Testes Laboratoriais e etc.
Atualmente a maior dificuldade para os usuários é determinar qual tipo de água reagente utilizar para cada processo laboratorial.

Os tipos, especificações, métodos de obtenção e controle da qualidade permitem aos profissionais de laboratórios especificar a água reagente com a qualidade e quantidade necessária para sua utilização diária.

TIPOS DE ÁGUA REAGENTE: As normas que orientam e especificam as aplicações são elaboradas por órgãos nacionais e internacionais para diversas aplicações possíveis. De acordo com especificações publicadas pelas autoridades: ANVISA, ACS – American Chemical Society, BSI – British Standards Institute, ISO – International Organization for Standardization, NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards, USP – United States Pharmacopeia. Uma destas normas é a ISO 3696 de 1987, que estabelece três tipos de água, cada uma com sua característica.

Água Reagente Tipo 1: Livre de colóides iônicos ou dissolvidos e de contaminantes orgânicos, este tipo é apropriado para técnicas analíticas. Deve ser produzida com um tratamento a partir de água tipo 2. Esta pode ser produzida através de uma osmose reversa ou deionização e filtração em membrana para remover bactérias e particulados. Deve ter as seguintes especificidades:

• Resistência especifica, megohm/cm a 25ºC (=10)
• Condutividade, microS/cm a 25ºC (=0,1)
  

Água Reagente Tipo 2: Possui baixos níveis de contaminantes orgânicos, inorgânicos ou colóides. Adequada para métodos analíticos sensíveis como espectrofotometria de absorção atômica. Esta pode ser produzida por múltipla destilação, por deionização ou osmose reversa.

• Resistência especifica, megohm/cm a 25ºC (>2,0)
• Condutividade, microS/cm a 25ºC (<0,5)
  

Água Reagente Tipo 3: Adequada para a maioria das aplicações laboratoriais na química úmida, preparação de soluções e reagentes. Esta pode ser produzida através de destilação simples, deionização ou osmose reversa.

• Resistência especifica, megohm/cm a 25ºC (>0,1)
• Condutividade, microS/cm a 25ºC (<10,0)
  

Água Reagente Ultra Pura: Água extremamente pura utilizada para preparar soluções injetáveis, exames microssonais e HPLC. Esta pode ser produzida com a utilização de dois ou mais processos de purificação, oxidação, que permitam a eliminação de contaminantes da água, ela não deve conter íons, substâncias orgânicas, silicatos, bactérias e substâncias em suspenção.

• Resistência especifica, megohm/cm a 25ºC (=18,2)
• Condutividade, microS/cm a 25ºC (=0,055)
  

CONTROLE DE QUALIDADE DA ÁGUA REAGENTE

Para obter um controle efetivo devemos realizar testes periódicos:

• Determinar a condutividade a 25ºC, verificando se esta dentro da faixa necessária para realizar o trabalho, através de um condutivímetro confiável diariamente.
• Teste microbiológico com contagem de colônias semanalmente.
• Determinar o pH a 25ºC, quando necessário.
• Determinar contaminação orgânica se necessário.
• Determinar da sílica solúvel, com SiO2 se necessário.